专利名称：应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体而言，特指应用家蚕生物反应器制备 人DNA聚合酶δ多亚基蛋白复合物的方法，通过这种方法，可以大量、廉价、高效地制备用 于进行体外研究DNA复制和损伤修复的DNA聚合酶。
背景技术：
“忠实”的DNA复制在真核细胞周期调控过程中起着关键作用，在细胞周期的某个 阶段发生调节紊乱，例如，在决定何时开始DNA的复制、或能否在S-期顺利完成DNA的复制 等，是人类多种疾病、特别是癌症疾病的重要起因。因此，准确的DNA复制和损伤修复在真 核生物维持其染色体稳定、防止遗传变异和癌症疾病发生等方面起着极其重要的作用。
而真核生物DNA聚合酶Pol δ (Polymerase δ, Pol δ )是染色体DNA复制 过程中最主要的复制酶，同时还参与多种形式的DNA损伤修复，在维持细胞周期的正常调 节以保证基因组结构的完整性和遗传稳定性方面具有特殊的重要意义。删除了酵母5 carerisiae中Pol δ催化大亚基/^ZJ基因，将导致细胞不能成活，即使在活性位点发生突 变，对细胞而言也是致命的(Boulet, A. et a 1, EMBO J, 1989，8: 1849 - 1854)0 Pol δ 是一种具有高度保真特性的DNA聚合酶，这种高保真特性还通过自身的3’ -5’核酸外切酶 活性得以加强，鼠基因在核酸外切酶活性位点D400的点突变将导致校对功能的丧失， 使得一半的老鼠在 2个月后患癌(Goldsby, R. E. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2002， 99: 15560 - 15565)，在人的直肠癌、结肠癌等多种癌细胞中均检出Pol δ催化亚基中存在 点突变或单个核苷酸删除突变(Flohr，Τ. et al, Int J Cancer, 1999，80: 919 - 929)。 由于Pol δ所具有的特殊生物学功能，目前越来越引起人们更加广泛地关注和重视。
真核生物Pol δ是由四个亚基ρ125、ρ50、ρ68和ρ12构成的异源四聚体，它作为 第一个具有3’ -5’核酸外切酶活性的真核DNA聚合酶，于上个世纪70年代在So A. G..博 士实验室被首次发现(Byrnes, J. J. , et al, Biochemistry, 1976，15:沘17_2823)。早 期从动物组织中分离纯化聚合酶Pol δ极度困难，至少需要8个分离柱，耗时数个月，从 1公斤小牛胰腺中仅能获得约33微克的蛋白(Lee，Μ. Y., et al, Biochemistry, 1984， 23: 1906-1913)，且极易失活，无法进行大规模的酶学功能和蛋白质结构分析，天然Pol δ 分离纯化的困难是真核聚合酶研究领域落后于其它系统DNA聚合酶研究的主要原因之一。 虽然在2002年应用AcMNPV昆虫杆状病毒一 Bac-to-Bac表达系统，通过制备各亚基病毒 共感染Sf9昆虫细胞获得了不同亚基装配组合的Pol δ蛋白复合物(Xie，B., et al, Biochemistry, 2002, 41: 13133-13142; Podust, V. N. , et al. , J Biol Chem, 2002, 277: 3894-3901)，但由于其表达量低，无法获得大量高纯度的酶，且酶制备过程中涉及昆 虫细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清，使得酶制备成本高，严重制约了 DNA聚合酶Pol δ领域的深入研究。
癌症疾病目前正在成为新世纪人类的第一杀手，从癌症发病的源头上研究由Pol δ功能改变而导致遗传基因组不稳定所致肿瘤发生的机制，为我们设计新的肿瘤诊断、治疗手段提供理论依据，其当务之急是寻找出一种经济，高效的真核DNA聚合酶Pol δ的制 备方法，以满足其结构和生物化学功能的研究之用。杆状病毒表达系统自八十年代建立、特 别是家蚕杆状病毒表达系统成为世界上最具商业开发价值的真核表达系统以来，已经成功 地表达了众多的外源基因。该系统的优点在于1.表达效率高，每条蚕产量可达毫克级以 上。2.表达的外源蛋白翻译后的修饰好于其它表达系统，其产物的生物化学特性和生物活 性可与天然产物相似。3.家蚕饲养简单方便，成本低。本发明提出一种利用家蚕作为生物 反应器大量、低成本、高效率地制备人DNA聚合酶Pol δ的方法。发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，首次提出一种应用家蚕生物 反应器高效、廉价、大规模制备人DNA聚合酶Pol δ的方法。
本发明所采用的技术方案是将完整的人类DNA聚合酶Pol δ的4个亚基ρ125、 ρ68、ρ50和ρ12的cDNA分别克隆到含多角体基因启动子的供体质粒pFastBac上，分别获 得重组供体质粒 pFastBac-pl25、pFastBac-p68、pFastBac_p50 禾口 pFastBac_pl2，在经过改 造的大肠杆菌DHlOBac/BmNPV中和家蚕BmNPV-Bacmid于Tn7转座子上发生转座，通过蓝 白斑筛选出带有正确亚基的克隆，随后在家蚕BmN细胞中分别制备该4种亚基不同装配组 合的重组病毒。用获得的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，收集含表达并包装了人DNA聚合酶 δ多亚基蛋白复合物的家蚕幼虫的体液或整体勻浆，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解， 4°C下进行高速离心，收集的上清应用免疫亲和层析和离子交换层析的方法进行分离纯化， 最终获得到纯化后的产物。
本技术方案所述的DNA聚合酶Pol δ的4个亚基分别为ρ125、ρ68、ρ50和ρ12， 相应的cDNA分别源自人类DNA聚合酶基因POLD1、P0LD3、P0LD2和P0LD4 ；所述的杆状病 毒是家蚕杆状病毒BmNPV ；所述的宿主昆虫为家蚕(Bombyx mori),品种为306 ；所述的宿 主昆虫感染时间是五龄期幼虫；所述的感染方法是经昆虫表皮注射接种感染；所述的杆状 病毒供体质粒是pFastBac，所制备的各单亚基重组家蚕杆状病毒是rBmNPV-pi^st-pl25、 rBmNPV-pFast-p68、rBmNPV-pFast-p50 和 rBmNPV-pFast_pl2 ；所制备的四个亚基不同 组合的重组家蚕杆状病毒是 rBmNPV-pFast-pl25/p50、rBmNPV-pFast-p 125/p50/p 12, rBmNPV-pFast-pl25/p68/p50 和 rBmNPV-pFast-p125/p68/p50/p12。
本技术方案所述的分离纯化具体操作是收集的经超声波裂解、高速离心后含表 达并包装了人DNA聚合酶δ多亚基蛋白复合物的上清，经过免疫亲和层析柱和离子交换层 析柱分离纯化出高纯度的目的产物。所说的免疫亲和层析柱推荐使用耦联了抗催化大亚基 Ρ125抗体的免疫亲和层析柱。离子交换层析柱是指FPLC Mono Q0
上述方法中所说的免疫亲和层析柱，是将抗P125的多克隆抗体与CarboLink Coupling Gel耦联而制得。其中，抗pl25的多克隆抗体是通过下述方法制得利用 Bac-to-Bac系统，制备含6个组氨酸标签的DNA聚合酶δ催化大亚基ρ125作为抗原，在成 年新西兰兔中制备抗Ρ125的抗血清，纯化抗血清获得高纯度的多克隆抗体。
本发明的突出优点表现为表达量高。插入4种亚基的重组供体质粒在经过改造的大肠杆菌DHlOBac/BmNPV中和 家蚕BmNPV-Bacmid于Tn7转座子上发生转座，经蓝白斑筛选出带有正确亚基的克隆，通过在家蚕细胞BmN中筛选优化获得的重组家蚕杆状病毒感染五龄起蚕第二天的家蚕幼虫，感 染5天后可获得高表达并装配完整的人DNA聚合酶Pol δ的四亚基蛋白复合物，经分离纯 化后，每条蚕可制备高达10微克以上的蛋白复合物。
生物活性高。家蚕杆状病毒表达系统是一种真核表达系统，其表达的外源蛋白翻 译后的修饰好于其它表达系统。本发明利用家蚕生物反应器所获得的人DNA聚合酶Pol δ 的四亚基蛋白复合物，经分离纯化后，比活性可达 20，000 Units/mg，接近或高于AcMNPVBac-to-Bac ^ ^ 20, 830 Units/mg (Xie, B. , et al, Biochemistry, 2002，41: 13133-13142)和 15，000 Units/mg (Podust, V. N. , et al. , J Biol Chem, 2002, 277: 3894-3901)。
成本低。家蚕是目前唯一可以大规模商业化无菌饲养的昆虫物种，由于避免了 AcMNPV杆状病毒一 Bac-to-Bac表达系统中昆虫细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清， 使得用家蚕作为生物反应器大量制备人DNA聚合酶Pol δ多亚基蛋白复合物成本低。
本发明通过以下附图和实施例作进一步详细阐述。
图1.不同亚基的各种组合在BmN细胞中表达和装配的Wfestern检测结果。1 四 个亚基所装配的Pl25/p68/p50/pl2全酶复合物；2，3 由ρ125/ρ50/ρ12和ρ125/ρ68/ρ50装 配成的三亚基蛋白复合物；4 :ρ125/ρ50装配成的核心酶二亚基蛋白复合物；5 催化大亚基 ρ125的单亚基表达。
图2.四亚基组合重组病毒在家蚕幼虫中表达和装配的Western检测结果。1，2，3 每100头蚕平均血样混合物中表达并装配的四亚基pl25/p68/p50/pl2组合的蛋白复合物。
图3.分离纯化后人DNA聚合酶Pol δ四亚基蛋白复合物的SDS-PAGE电泳结果。 1，2:经过免疫亲和层析柱纯化后，合并的蛋白峰馏分再经过离子交换层析柱纯化和浓缩， 所收集的第14和第15馏分。
图4. Poly(dA)/oligo(dT)为引物/模板的分析结果。图中两条斜线分别代表反 应中加和不加PCNA。
图5. Pol δ四亚基蛋白复合物的斯托克斯半径测定。横坐标为经测定计算的一 log[Kav]，纵坐标为斯托克斯半径Α。图中a，b，c, d, e分别代表标准蛋白Bovine serum albumin(67 000，35. 5 A),Aldolase (158 000，48. 1 A),Catalase (232 000，52. 2 A), Ferritin (445 000， 61 A), Thyroglobulin (667 000， 85 A)。
图6是制备的重组杆状病毒rAc-p!^ast-His-pl25的^festern检测结果。右边的 数字代表标准蛋白Marker; 1，2 两个平行的病毒转染实验。
图7利用镍柱纯化的His_pl25蛋白洗脱图。M 标准蛋白Marker ；E1-E4 收集的 蛋白馏分。
图8经过Immobilized Protein A柱纯化后的抗体在SDS-PAGE胶上的分析结果。 M:标准蛋白Marker ；3，6，9，12，15，18，21，24，27，30 为洗脱后所收集的抗体馏分编号。
具体实施方式
实验材料限制性内切酶、连接酶、RNA酶、IPTG、X-Gal, SDS、TEMED、丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺为 Promega公司产品；PCR试剂盒、大肠杆菌培养基LB、昆虫细胞培养基TC-100、胎牛血清、 CELLFECTIN Reagent等化学试剂购自GIBCO BRL公司；人类DNA聚合酶Pol δ的4个亚基 ρ125、ρ68、ρ50和pl2 cDNA 由美国范德堡大学(VanderbiIt University)Ellen H. Fanning 教授惠赠(Genbank ID :NM_002691. 2,NM_006591. 1,NM_001127218. 1 ；NM_021173. 3，);杆状 病毒供体质粒PFastBac 和 pFastBacHTc 购自 GIBCO BRL 公司；CarboLink Coupling Gel、 Immobilized Protein A柱、带组氨酸标签蛋白纯化试剂盒均购自Pierce公司；多克隆抗 体制备所需动物和材料由江苏大学实验动物中心提供；大肠杆菌DH5 α (可从Takara公司 购买)；经改造的大肠杆菌DHlOBac/BmNPV、家蚕细胞BmN和家蚕品种306 (Liang, G.，et al, Current Microbiology, 61(3) 190-196，D0I: 10. 1007/s00284-010-9595_4)由江 苏大学生命科学研究院保存；DHlOBac和昆虫细胞Sf_9由江苏大学生命科学研究院保存， 也可从BD bioscience 公司购买。人类PCNA (由 New York Medical College 的Marieetta Lee教授惠赠)、分别抗4种亚基的抗体α-ρ125、α-ρ68、α-p50 (购自Abnova公司)和 α -ρ12、耦联了抗大亚基ρ125兔源免疫亲和层析柱按实施例制备。
说明以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》 (Sambrook等编著，科学出版社，1992年版)、试剂盒说明书、及产品说明书进行。
实施例一多克隆抗体的制备1. 抗原的制备(1).重组供体质粒pFastBaCHTC-pl25的制备化学合成用于PCR扩增反应的两条引 物分别为F: 5’ -AGCTACGGATCCGGATGGATGGCAAGCGGCGGCC-3’ ( SEQ ID NO 9), R: 5’ -AGCTACGAATTCTCACCAGGCCTCAGGTCCAGGG-3’ (SEQ ID NO 10),在引物序列N —端引入汉3 HI酶切位点，在C-端引入feoRI酶切位点，均用下划线表 示。以人类DNA聚合酶Pol δ的催化大亚基ρ125的cDNA为模板进行PCR反应，扩增出的 DNA片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，切割下含目的片段的凝胶，用QIAGEN Gel Extraction 试剂盒回收扩增出的DNA片段(Genbank ID :NM_002691. 2);用汉警HI和&0RI对扩增出的 DNA片段进行双酶切，同时，对含6个组氨酸标签的供体质粒pFastBacHTc也进行汉a HI和 ^oRI的双酶切反应，酶切反应产物分别用试剂盒再纯化一次，将酶切后纯化的PCR产物和 供体质粒pFastBacHTc用连接试剂盒进行连接反应，14°C下过夜；将连接产物于大肠杆菌 DH5a感受态细胞中进行转化反应，反应混合物涂于含100 Pg/ml氨苄青霉素的LB培养基 平板上，37°C倒置培养过夜；挑选LB平板上的单个菌落，经LB液体培养基培养，抽提质粒 DNA ；对质粒DNA用BanMl和进行双酶切鉴定，筛选出已插入正确基因片段的重组供 体质粒。经序列检测，成功获得含正确序列的重组供体质粒pFastBaCHTC-pl25。
(2).重组杆状病毒的制备将获得的重组供体质粒转化大肠杆菌感受态细胞 DHlOBac，在Helper作用下通过Tn7转座子发生转座，经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体；提 取重组的 Bacmid DNA，用特异性引物 Μ13 (Forward: M13-47, Reverse: RV-M)进行 PCR 反 应验证；用CELLFECTIN Reagent介导重组的Bacmid DNA转染Sf_9细胞，经两轮病毒的扩 增，收集上清，获得重组杆状病毒rAc-p!^St-HiS-pl25。裂解转染的细胞，经SDS-PAGE电 泳，将胶分离后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用鼠源抗His的单克隆抗体(购自于Abcam 公司)进行免疫反应，带6XHis标签的His-pl25的Western检测结果如图6所示。
(3).蛋白的纯化用重组病毒rAc-p!^St-HiS-pl25感染1 L悬浮培养的Sf-9昆 虫细胞，MOI = 2，感染细胞密度为2X IO6 cells/ml，72小时后收集感染的细胞，在4 下 以3000 rpm速度离心10分钟，按照试剂盒说明书，用镍柱纯化带组氨酸标签的pl25，洗脱 的蛋白如图7所示。
合并洗脱下的各蛋白馏分，再经过一次SDS-PAGE胶纯化，将胶上的His_pl25用 手术刀小心割下，切碎，置于离心管中，用抽提液将胶上的蛋白洗脱，高速离心，合并经多次 抽提的含 His-pl25 的上清，用 Centricon 30 filters (30 000 MW cutoff, Millipore) 进行浓缩，浓缩后的His-pl25经蛋白浓度测定后，用作免疫反应的兔抗原。
2. 抗血清的制备(1).预放血将成年新西兰兔放在特制兔盒中，按压兔子耳根部直至血管突出，用19 号针头对兔子耳动脉进行预放血1-5 ml，获得免疫前的血清。4° C放置过夜使血液凝固， 将血液转移至塑料离心管中，4° C下10，000 g离心10分钟，收集的上清液在4° C下保 存。
(2).免疫反应固定两只成年新西兰兔，将Iml抗原溶液(200 Pg兔抗原溶入Iml 磷酸缓冲溶液中)与Iml加入分枝杆菌的福氏完全佐剂混和，剧烈震荡使之充分乳化，用 3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，在兔子的4个不同部位皮下各注射1/4抗原溶液 (两处在后背，两处在大腿处)；注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用 70%乙醇在注射处消毒，用相同方法给另一只家兔注射抗原。第2星期，通过注射混合200 Pg抗原的完全弗氏佐剂进行一次加强免疫；在第4、第6星期，分别再注射混合100 Pg抗原 的不完全弗氏佐剂进行加强免疫。最后一次注射抗原后的第7天按照步骤(1)收集血液， 将收集的血液与注射前收集的血液用Western Blotting鉴定比较，发现已经有大量的抗体 产生。
(3).收集抗血清将兔子轻轻放入固定架上，用刀片在耳部血管的上中部切出切 口，使血液自由的流出，收集大约30-40 ml/兔滴出的血液，将血液在37° C恒温箱中放置 30分钟，再在4° C放置过夜，将血液转移至塑料离心管中，在4° C下10，OOOg离心10分 钟，收集上清液，获得抗血清。
3. 抗体的纯化将预先配置好的100%硫酸铵饱和溶液在磁力搅拌下缓慢滴加到抗血清中，使硫酸铵 的终浓度达到20%，在4° C下静置过夜。于4° C下10，OOOg离心30分钟以去除细胞碎片 和杂蛋白，再在磁力搅拌下缓慢滴加100%硫酸铵饱和溶液到收集的离心上清中，使硫酸铵 的终浓度达到50%，4° C下静置过夜；10，OOOg离心30分钟，弃上清，保留沉淀；将沉淀溶 于少量PBS中，溶解后的沉淀放入透析袋对含0.2 g /L叠氮钠的PBS于4° C下透析M 小时，每隔6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨，透析液经高速离心后，收集上 清，测定蛋白质含量，然后按照Pierce产品说明书，对经初步纯化后的抗体用Immobilized Protein A柱进行再纯化，收集洗脱的各馏分，测定蛋白浓度，Western Blotting进行免疫 反应鉴定。成功地获得大约600 mg高纯度的抗体α-pl25，其纯化后产物在SDS-PAGE胶上 的分析结果如图8所示。
实施例二 免疫亲和层析柱的制备按照Pierce公司产品说明书(产品号20391 )，将300 mg纯化好的多克隆抗体7α -ρ 125和50 ml的CarboLink Coupling Gel进行耦联反应，制备成多克隆抗体耦联的 免疫亲和层析柱。大约有225 mg的IgG被耦联到胶上，耦联效率达到75%，即平均每毫升的 胶耦联4. 5毫克抗体。
实施例三重组供体质粒的构建化学合成用于PCR扩增4种亚基的引物，在引物序列N —端引入Bernm酶切位点，在 C-端引入feoRI酶切位点，均用下划线表示，引物序列设计如下pl25 F:5，-AGCTACGGATCCGGATGGATGGCAAGCGGCGGCC--3，(SEQ ID NO 1)R:5，-AGCTACGAATTCTCACCAGGCCTCAGGTCCAGGG--3，(SEQ ID NO 2)p68 F:5，-AGCTACGGATCCTTATGGCGGACCAGCTTTATCT--3，(SEQ ID NO3)R:5，-AGCTACGAATTCTTATTTCCTCTGGAAGAAGCCA--3，(SEQ ID NO 4)p50 F:5，-AGCTACGGATCCACATGTTTTCTGAGCAGGCTGC--3，(SEQ ID NO 5)R:5，-AGCTACGAATTCTCAGGGGCCCAGCCCCAGGCC-3，(SEQ ID NO 6)pl2 F:5，-AGCTACGGATCCCCATGGGCCGGAAGCGGCTCAT--3，(SEQ ID NO 7)R:5，-AGCTACGAATTCTCATAGGGGATAGAGATGCC-3y(SEQ ID NO 8)应用以上引物，以人类DNA聚合酶Pol δ的4个亚基cDNA为模板进行PCR反应， 扩增出的各亚基片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，切割下含目的片段的凝胶，用QIAGEN Gel Extraction试剂盒回收扩增出的DNA片段；用Bamm ^WEcoRl对扩增出的DNA片段进行双 酶切，同时，对供体质粒PFastBac也进行汉a HI和的双酶切反应，酶切反应产物分别 用试剂盒再纯化一次，将酶切后纯化的PCR产物和供体质粒pFastBac用连接试剂盒进行连 接反应，14°C下过夜；将连接产物于大肠杆菌DH5 α感受态细胞中进行转化反应，反应混合 物涂于含100 μδ/πι1氨苄青霉素的LB培养基平板上，37°C倒置培养过夜；挑选LB平板上的 单个菌落，经LB液体培养基培养，抽提质粒DNA ；对质粒DNA用Ba·和进行双酶切 鉴定，筛选出已插入正确亚基的重组供体质粒。经序列检测，成功获得分别含各亚基正确序 列的重组供体质粒 pFastBac_pl25、pFastBac_p68、pFastBac_p50 禾口 pFastBac_pl2。
实施例四含单亚基重组家蚕杆状病毒的制备将实施例三中所构建的重组供体质粒分别转化含BmNPV-Bacmid的大肠杆菌感受 态细胞DHlOBac，在Helper作用下通过Tn7转座子发生转座，经蓝白斑筛选得到重组穿 梭载体，分别提取含各亚基基因片段的重组Bacmi d DNA，用特异性M13引物(Forward M13-47, Reverse: RV-M)进行 PCR 反应验证；用 CELLFECTIN Reagent 介导重组的 Bacmid DNA转染家蚕BmN细胞，经两轮病毒的扩增，获得含各亚基的单个重组家蚕杆状病毒 rBmNPV-pFast-pl25, rBmNPV-pFast-p68, rBmNPV-pFast-p50 禾口 rBmNPV-pFast_pl2。
同时利用AcMNPV-Bac-to-Bac系统(购自hvitrogen公司)，在Sf_9细胞中制 备出重组 AcMNPV 杆状病毒 rAc -pFast_pl25、rAc -pFast_p68、rAc -pFast_p50 禾口 rAc -pFast-pl2供其它实验使用。
实施例五各亚基不同组合重组家蚕杆状病毒的制备测定实施例四中所制备的各亚基单个重组病毒的滴度，按1:1的病毒滴度比例 共感染家蚕BmN细胞，细胞感染4 一 6天后，收集细胞和感染液混合物，在4 下以 10, 000 rpm速度离心2分钟，获得的上清即为制备的各亚基不同组合的重组家蚕杆状 病毒母液 rBmNPV-pFast-pl25、rBmNPV-pFast-p 125/p50 > rBmNPV-pFast-p 125/p50/p 12 >rBmNPV-pFast-pl25/p68/p50 和 rBmNPV-pFast_pl25/p68/p50/pl2，裂解离心后的转染细 胞，经过SDS-PAGE电泳，将胶分离后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，在各亚基相应位置用 医用剪刀将膜剪成条，含各亚基的膜条用相对应的抗体进行免疫反应，经Western检测，其 病毒感染和各种不同亚基组合在BmN细胞中的表达和装配情况如图1所示。
实施例六四亚基组合重组病毒在家蚕中的表达和装配将实施例五所制备的四亚基组合的重组家蚕杆状病毒rBmNPV-pi^st-pl25/p68/p50/ pl2接种五龄起蚕第二天的家蚕(306品种)，每条蚕接种1.0X105 PFUJP 5μ1接种母液中 含2 X IO7 PFU/ml，共接种大约300头蚕，收集4 一 5天发病后的蚕血，从每100头蚕血平均 混合液中取5 μ 血样，如实施例三方法进行Wfestern检测，四亚基组合重组病毒在家蚕306 中的表达和装配如图2所示。
实施例七分离纯化后的酶活性收集实施例六中表达并装配了人DNA聚合酶δ四亚基蛋白复合物的蚕血，用专用裂解 缓冲液稀释，经超声波裂解、高速离心后取上清，经过免疫亲和层析柱和离子交换层析柱分 离纯化，获得高纯度的目的产物，SDS-PAGE电泳分析结果如图3所示，蛋白纯度在95%以上， 平均每条蚕可获得约10微克纯化后的Pol δ四亚基蛋白复合物；以P0ly(dA)/0lig0(dT) 为引物/模板的初步分析结果如图4所示，其比活性约为20，000 Units/mg,PCNA的刺激倍 数接近8倍。
实施例八家蚕中表达组装的Pol δ四亚基蛋白复合物的分子量取250微升实施例五中经过FPLC MonoQ纯化后的第15号馏分，在分子筛FPLC Superose 6上测定其分子量，如图5所示，斯托克斯半径(Stokes radius)大约为60. 5A。根 据标准蛋白分子量的标准曲线，所测定的Pol δ四亚基蛋白复合物的分子量约为228 KDa, 接近由氨基酸序列计算的理论值239 KDa，四个亚基在体内以1 :1的分子比例装配。
本发明利用家蚕生物反应器所制备的人类DNA聚合酶Pol δ四亚基蛋白复合物 在家蚕体内得到高效地表达和正确装配，制备的Pol δ四亚基蛋白复合物在家蚕体内的翻 译后修饰好，具有很高的生物活性。
权利要求
1.应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法，包括将组成人DNA聚合酶δ的 4个亚基ρ125、ρ68、ρ50和ρ12的基因分别构建到杆状病毒供体质粒pFastBac上，分别得 至Ij重组质粒 pFastBac_pl25、pFastBac_p68、pFastBac_p50 禾Π pFastBac_pl2，在经过改造的 大肠杆菌DHlOBac/BmNPV中和家蚕BmNPV杆状病毒DNA于Tn7转座子上发生转座，通过蓝 白斑筛选出带有正确亚基的克隆，随后在家蚕BmN细胞中制备该4种亚基不同装配组合的 重组病毒，用获得的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，在宿主昆虫家蚕体内表达并包装成多亚 基蛋白复合物的人DNA聚合酶δ经分离纯化后获得。
2.按照权利要求1所述应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法，其特征在 于所述的重组病毒是通过表皮注射来感染5齢幼虫。
3.按照权利要求1所述应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法，其特征在 于所述的分离纯化是指收集含表达并包装了人DNA聚合酶δ多亚基蛋白复合物的家蚕幼 虫的体液或整体勻浆，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，4 下进行高速离心，收集的上 清经过免疫亲和层析柱和离子交换层析柱分离纯化，获得到纯化后的产物。
4.按照权利要求3所述应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法，其特征在 于所说的免疫亲和层析柱，是将抗Ρ125的多克隆抗体与CarboLink Coupling Gel耦联 而制得。
5.按照权利要求4所述应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的的方法，其特征在 于，其中，抗Ρ125的多克隆抗体是通过下述方法制得利用Bac-to-Bac系统，制备含6个组 氨酸标签的DNA聚合酶δ催化大亚基ρ125作为抗原，在成年新西兰兔中制备抗ρ125的抗 血清，纯化抗血清获得高纯度的多克隆抗体。
全文摘要
本发明涉用应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法。具体是将人DNA聚合酶δ的4个亚基分别构建到供体质粒上；在经过改造的大肠杆菌DH10Bac/BmNPV中和家蚕BmNPV杆状病毒DNA中Tn7转座子上发生转座，筛选出带有正确亚基的克隆，随后在家蚕BmN细胞中制备该4种亚基不同装配组合的重组病毒；感染宿主家蚕，在家蚕体内进行多亚基蛋白复合物的表达和装配；收集感染后的幼虫体液或整体匀浆，经分离纯化后获得目的产物。通过本发明可以高效、低成本、大规模地制备高比活、正确装配的DNA聚合酶多亚基蛋白复合物；能够被广泛地应用于某些重要疾病、特别是癌症疾病研究领域涉及DNA复制和损伤修复之基础研究。
文档编号C12N9/00GK102031263SQ201010556599
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者刘晓勇, 周亚竟, 姚勤, 李国辉, 李骁, 王玉珏, 陈克平, 陈慧卿, 陈焰, 麦维军 申请人:江苏大学