具有增强子作用的家蚕BmHel-10转座子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及的是一种来自家蚕的具有显著增强下游基因表达的滚环式转座子(BmHel-10)。该增强子由SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列组成。本发明是通过生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定获得并通过双荧光素酶报告基因检测方法验证其具有增强子的功能，该发明不但有助于获取高丰度的目的蛋白推动家蚕生物反应器的发展而且有利于家蚕品种的改良。
【专利说明】具有增强子作用的家奋BmHe 1-10转座子
【技术领域】
[0001]本发明涉及的生物【技术领域】，主要是家蚕转基因生物反应器和品种改良领域。
【背景技术】
[0002]滚环式转座子(Helitixm)最初是在模式生物拟南芥，水稻和线虫基因组中被发现并且被归类为DNA类转座子(Kapitonov and Jurka2001)。但是Helitron转座子的序列结构和转座机制都与其它DNA类转座子完全不同。在转座机制上，由于完整的Helitron转座子编码的转座酶包含复制起始(Rep)和解螺旋酶(Helicase)的保守基序，所以它们被认为是以滚环式机制进行转座的并且偏向于插入到基因组的AT 二核苷酸内。在序列结构上，它们的5’端是以TC 二核苷酸起始，3’端是以CTRR(R代表A或G)四个核苷酸终止，并且在其3’端通常具有一个颈环结构(Mendiola et al.1994)。
[0003]近年许多研究表明Helitron转座子广泛的发布于高等真核生物基因组内，例如在线虫中有超过2%，青蛙中超过0.5%，蝙蝠中大约3%，玉米中大约2%和果蝇中1-5%的基因组序列是由 Helitron 转座子组成(Kapitonov and Jurka2001, Kapitonov2006, Prithamand Feschotte2007, Du et al.2009, Yang and Bennetzen2009)。虽然 Helitron 转座子在许多真核生物中被报道，但是Helitron转座子在鳞翅目昆虫基因组中却尚未报道。最近，我们用基于结构和同源性搜索相结合的方法对家蚕的全基因组Helitron转座子进行了鉴定和注释，结果发现家蚕基因组中具有21个Helitron转座子家族(被命名为BmHel-1到BmHel-21)，约占整个家族基因组序列的4.23%。 [0004]虽然近年许多物种的Helitron转座子相继被报道,但是对于Helitron转座子的研究仍停留在全基因组鉴定上。真核生物基因组中为什么会保留如此多的Helitron转座子序列？究竟具有什么功能？仍鲜有报道。最近我们应用双荧光素酶报告基因检测系统发现家蚕的BmHel-1O具有显著地增加其下游基因表达的功能。
【发明内容】
[0005]本发明是利用生物信息学，分子和细胞生物学方法在家蚕中鉴定并证实了家蚕BmHel-1O转座子起到了增强子的作用。目的在于将该元件构建到表达载体或者转基因载体中可以有效增加目的基因表达的效果。
[0006]本发明 申请人:利用生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定了一个Helitron转座子BmHel-ΙΟ。应用PCR和TA克隆的方法在家蚕基因组中获得了该转座子的序列。测序验证为我们的目的序列。然后将该转座子分别连接到细胞转染载体pGL3-Basic Vector载体的报告基因的5’端，再将这两个载体分别进行家蚕的细胞(BmN)转染实验，结果证实了BmHel-1O转座子具有增强子的作用。这不但有助于原核或真核表达获取高丰度的目的蛋白而且对家蚕生物反应器的发展也将起到推动作用。
[0007]本发明的家蚕增强子BmHel-1O通过以下步骤获得和证实:
[0008](I)家蚕BmHel-1O转座子的鉴定:首先应用基于结构和同源性搜索相结合的方法在家蚕9倍基因组序列中进行Helitron转座子序列的搜索。结果在家蚕基因组中鉴定出BmHel-1O转座子。该转座子的一致序列(consensus sequence)长度531bp, 5’端以ATC三核苷酸起始，3’端以CTAGT五个核苷酸终止。进一步以BmHel-1O的一致序列作为问询序列，用BLASTN程序在家蚕9倍基因组数据库中搜寻BmHel-1O的同源序列(e值<e_6，相似度>80%，序列长度>80bp)，最终发现BmHel-1O转座子家蚕基因组中具有21个拷贝。
[0009](2)家蚕BmHel-1O转座子序列的获得:以家蚕大造品系的基因组DNA为模板，BmHel-1O转座子的核苷酸序列设计特异性引物(上游引物为:5’ -GGTACCATCTATTTATATAAAAATGAATTGC-3’ ；下游引物为:5’ -CTCGAGACTAGCTGTACCCGTCCGC-3’ 下划线分别为限制性内切酶KpnI和XhoI酶切位点)进行PCR扩增，获取目的条带，PCR产物回收后与PMD-19-T载体连接转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致。
[0010](3)将目的片段构建到细胞转染载体
[0011]将含有目的片段(BmHel-1O)的T克隆载体和细胞转染载体pGL3_Basic Vector分别用限制性内切酶KpnI和XhoI进行双酶切，分别回收目的片段和载体骨架，电泳检测后，用DNA连接酶将目的片段BmHel-1O与细胞转染载体连接，并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选获得含有BmHel-1O重组质粒的克隆，然后将扩大培养的菌液送往上海生工生物工程公司测序，测序结果与第一次测得的序列一致，获得正确的克隆；
[0012](4)细胞转染结果
[0013]将构建好的具有BmHel-1O转座子插入和没有BmHel-1O转座子插入的细胞转染载体分别与内参质粒和转染试剂一同转入家蚕的卵巢细胞系(BmN)内，转染后的细胞27°C培养24~48个小时候后，用荧光素酶活性检测仪来检测这两种报告基因的表达量。
[0014]本发明的优点是:
[0015]目前对于家蚕的研究已进入后基因组即功能基因组时代，根据已有的报道大量与家蚕抗性和丝蛋白产量相关的基因被鉴定。然而寻找到合适的增强子来增加这些基因在家蚕中的表达以期获得抗病力强和高产茧丝的家蚕品种变得尤为迫切。所以我们发明的这一增强子不但有望推动家蚕优良品种的繁育而且可能对家蚕生物反应器的发展起到推动作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为双荧光素酶报告基因检测结果。
【具体实施方式】
[0017]实施例1:
[0018]家蚕BmHel-1O转座子的鉴定:应用基于结构和同源性搜索相结合的方法在家蚕9倍基因组序列中进行 Helitron转座子序列的搜索。结果在家蚕基因组中鉴定出BmHel-1O转座子。该转座子的一致序列(consensus sequence)长度531bp (见SEQ ID NO:1)。
[0019]实施例2:
[0020]家蚕BmHel-1O转座子对下游基因表达增强作用的鉴定:为了探测BmHel-1O是否对邻近基因的表达具有调控作用，我们进行了双荧光素酶报告基因转染实验。我们首先将家蚕的A3启动子序列构建到萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3Basic Vector)的报告基因的5’端，然后再将BmHel-1O的序列构建到A3启动子的前面。然后将这个构建好的载体和内参载体(海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕卵巢细胞(BmN)，转染48小时后测酶活。结果发现当荧光素酶报告基因的5’端插入了 BmHel-1O时，显著的增加了报告基因的表达量(Ρ〈0.01)( 见附图1)。
【权利要求】
1.具有增强子作用的BmHel-1O转座子，其特征在于该转座子是家蚕来源的，序列组成如 SEQ ID NO:1 所示。
2.根据权利要求1的增强子，其中所说的增强子来源于家蚕BmHel-1O转座子。
3.根据权利要求1或2，其中所说的家蚕是家蚕大造品系。
4.根 据权利要求1中的增强子BmHel-1O转座子在构建家蚕重组表达载体并提高外源或内源基因表达产物的产率中的应用。
【文档编号】C12N15/866GK103923932SQ201410191408
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】张泽, 韩民锦 申请人:重庆大学