专利名称：用dna指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及采用DNA指纹技术对家蚕(Bombyx mori L.)杂交率进行鉴定的方法。
家蚕杂交种是蚕茧生产高产稳产的基本保证，杂交种的杂交率(蚕种中杂交种的比率)的高低，与蚕农的经济效益关系密切。为了维护蚕农的利益，蚕种的杂交率已作为蚕种质量检验的法定项目，经检验不合格的蚕种被限制使用。目前对杂交率的鉴定方法是采用直接饲养二匾蚕(约1000头蚕)、以大蚕期蚕体的斑纹为依据进行亲本和杂交种的判别，按样本实际检出的亲本个体数为依据计算样本杂交率，以样本杂交率作为总体杂交率。这种鉴定方法存在以下五个问题1)由于日×中的杂交品种，其杂交种与日系亲本的斑纹一样，都为普通斑纹，所以依靠斑纹不可能作出正确判别。即现行的判别方法，只能对中×日的杂交种进行判别，不能对日×中的杂交种进行判别；2)由于原种生命力比杂交种虚弱，容易发生病小蚕，在养蚕期间已被淘汰，降低了原种在杂交种中的比率，所以使鉴定得到的杂交率数值偏高；3)按照数理统计的抽样分布理论，亲本在蚕种中的分布属超几何分布、二项分布、或普松分布，虽然亲本在总体中的比率为一定值，但样本中亲本出现的个体数各种各样，亲本的比例按一定概率出现，并不永远与总体中的比例相同，所以按样本实际检出的亲本个体数，推断总体杂交率，结果常常是不正确的；4)春制秋用种，由于制种结束至用种期的时间较短，在鉴定结果出来之前，蚕种已被发到农村饲养，失去了检验的目的；5)为了对春用品种进行鉴别，需要在春蚕期以前，将蚕种空运到南方比较温暖的省市提前催青饲养，使非南方省份的蚕区化费大量人力、物力。
利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)技术建立的DNA指纹亲子判断方法，是利用个体的DNA为模板，采用能够扩增出特征DNA片断的引物，根据DNA分子水平的异同点，进行亲子鉴别。方法先进，结论正确。但为了获取个体的DNA，常用的抽提方法都需要经过多步反应，并用有机溶剂，如酚、氯仿、异戊醇等除去蛋白质，方法繁琐，时间较长，花费较大。
将DNA指纹亲子判断方法应用于家蚕杂交率的鉴定方面，能够获得全面、正确的鉴定结果。但由于家蚕杂交率鉴定需要检测很多样本，常规的DNA抽提方法不能适应需要。所以必须建立一种快速、经济的抽提DNA的方法。另外还需要用几种能够扩增出用于亲子鉴别的特异性DNA片断的引物。为了能够由样本的结果正确地推断总体，需要应用数理统计的原理，制定适当的抽样比例，建立由样本杂交率推断总体杂交率的方法。
本发明的目的是建立一种快速、合理、正确、实用、取材方便、适合于所有生产用家蚕品种的用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是(1)DNA模板的提取第一步取1粒蚕卵或1条蚁蚕，加入10～100μl 0.1～1.0mol/LNaOH,0.5～2.5％ME缓冲液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl 50～200mmol/LTris-HClpH6～9缓冲液，搅拌10min,10000～15000×g、4℃离心5～20min。
第二步取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min,10000～15000×g、4℃离心5～30min，用10～100μl无菌去离子水溶解，即得到PCR反应所需的DNA模板。
(2)PCR反应的引物如下随机引物，可在目前生产用蚕品种的亲本与杂交种之间形成特征性的谱带，用于杂交率的鉴定。
(3)PCR反应条件PCR反应体系上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；Taq DNA聚合酶0.2～5u；按总体积1/10的量加入10倍PCR反应缓冲液，组成成分100mM/LTris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0；dNTP 0.15～0.25 mmol/L；加上述DNA合成引物，使终浓度为0.1～1.5μmol/L；加无菌去离子水，使总体积达到10～100μl；PCR反应条件94～95℃预热4～5min；变性解链94℃ 0.5～2min；复性30～50℃ 0.5～2min；合成延伸70～75℃1～5min；循环30～45次；保存70～75℃,5～10min；4℃,0.5～12h；反应设备PCR反应仪；(4)DNA电泳采用0.8～1.5％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用0.5～1％TAE或TBE。(5)样本容量取100～1000粒蚕卵或蚁蚕作为样本，供杂交率鉴定用，用样本的结果推断总体的结果，正确率可达到95～99％。
本发明具有的有益效果是1)用胚胎形成到蚁蚕孵化的任何时期的蚕卵或蚁蚕为材料，取材方便；2)用2步方法提取DNA模板，快速、简单；3)所用DNA合成引物能在现行生产用蚕品种的亲本与杂交种之间扩增特异性的DNA片断，建立的每一品种的亲本和杂交种的特征性DNA电泳参照图谱，可作为杂交率鉴别的依据；4)按照数理统计的原理设定样本数，按照抽样分布的理论，计算出由样本杂交率推断总体杂交率的概率，设定的正确率为95～99％，正确性高。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置15min,15000×g、4℃离心15min，沉淀用20μl无菌去离子水溶解，作为PCR反应所需的DNA模板。
(2)PCR反应引物采用ZHD0020引物，序列为TAGGTCTTGGG。
(3)PCR反应条件设定PCR反应体系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶2.5u10×PCR反应缓冲液(成分组成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)10μldNTP各0.2mmol/LZHD0020引物，使终浓度为0.5μmol/L加无菌去离子水，使总体积达到100μlPCR反应条件94℃预热4min变性解链94℃ 1min复性37℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循环35次保存72℃,5min,4℃,5h。
(4)DNA电泳采用1％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用1％TAE。
(5)结果PCR反应合成的DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳分离，秋丰品种具有1、2、3和5共4条带，白玉品种具有1、2和4共3条带，秋丰×白玉、白玉×秋丰两个杂交种都具有1、2、3、4和5共5条带。两个亲本的DNA片断在两个杂交种中都存在，结果符合遗传规律。亲本与杂交种的DNA电泳图谱的特征具有明显差异，所以可用于杂交种的杂交率鉴定。10次实验结果都相同，故确定这种电泳图谱为秋丰、白玉及其杂交种的电泳参照图谱。
实验从浙江大学动物科学学院蚕蜂科学系遗传育种教研组繁育的蚕种秋丰×白玉中抽取200粒蚕卵，按上述PCR反应获得每一粒蚕卵的DNA片断，经琼脂糖电泳发现，有4粒蚕卵的DNA电泳图谱与秋丰品种的电泳图谱相同，其他196粒蚕卵的DNA电泳图谱与秋丰×白玉品种的电泳图谱相同，按二项分布统计分析原理，推断该批蚕种的杂交率在95％以上，并得知这一结论的正确率(概率值)在95％以上。
取上清液40μl，加100μl 99％酒精，-20℃中放置15min,15000×g、4℃离心20min，沉淀用20μl无菌去离子水溶解，作为PCR反应所需的DNA模板。
(2)PCR反应引物采用ZHD0029引物，序列为GCAGCACTGAC(3)PCR反应条件设定PCR反应体系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶5u10×PCR反应缓冲液(成分组成100 mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)20μldNTP各0.22mmol/LZHD0029引物，使终浓度为0.8μmol/L加无菌去离子水，使总体积达到200μlPCR反应条件94℃预热4min变性解链94℃ 1.5min复性40℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循环35次保存72℃,5min,4℃,4h。
(4)DNA电泳采用1％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用1％TAE。
(5)结果PCR反应合成的DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳分离，华秋品种具有1、3和4共3条带，松白品种具有1、2和4共3条带，华秋×松白、松白×华秋两个杂交种都具有1、2、3和4共4条带。两个亲本的DNA片断在两个杂交种中都存在，结果符合遗传规律。亲本与杂交种的DNA电泳图谱的特征具有明显差异，所以可用于杂交种的杂交率鉴定。50次实验结果都相同，故确定这种电泳图谱为华秋、松白及其杂交种的电泳参照图谱。
实验从浙江省湖州蚕桑科学研究所繁育的蚕种华秋×松白中抽取100粒蚕卵，按上述PCR反应获得每一粒蚕卵的DNA片断，经琼脂糖电泳发现，有1粒蚕卵的DNA电泳图谱与华秋品种的电泳图谱相同，其他99粒蚕卵的DNA电泳图谱与华秋×松白品种的电泳图谱相同，按二项分布统计分析原理，推断该批蚕种的杂交率在95％以上，并得知这一结论的正确率(概率值)在95％以上。
取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置30min,10000×g、4℃离心18min，沉淀用20μl无菌去离子水溶解，作为PCR反应所需的DNA模板。
(2)PCR反应引物采用ZHD0013引物，序列为AGTGCCTAACC。
(3)PCR反应条件设定PCR反应体系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶2.5u10×PCR反应缓冲液(成分组成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20 mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)10μldNTP各0.18mmol/LZHD0013引物，使终浓度为0.7μmol/L加无菌去离子水，使总体积达到100μlPCR反应条件
94℃预热4min变性解链94℃ 1min复性38℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循环35次保存72℃,5min,4℃,3h。
(4)DNA电泳采用1％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用1％TAE。
(5)结果PCR反应合成的DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳分离，华丰品种具有1、2和4共3条带，雪松品种具有1、2和3共3条带，华丰×雪松、雪松×华丰两个杂交种都具有1、2、3和4共4条带。两个亲本的DNA片断在两个杂交种中都存在，结果符合遗传规律。亲本与杂交种的DNA电泳图谱的特征具有明显差异，所以可用于杂交种的杂交率鉴定。20次实验结果相同，故确定这种电泳图谱为华丰、雪松及其杂交种的电泳参照图谱。
实验从浙江大学动物科学学院蚕蜂科学系遗传育种教研组繁育的蚕种华丰×雪松中抽取300粒蚕卵，按上述PCR反应获得每一粒蚕卵的DNA片断，经琼脂糖电泳发现，有8粒蚕卵的DNA电泳图谱与华丰品种的电泳图谱相同，其他292粒蚕卵的DNA电泳图谱与华丰×雪松品种的电泳图谱相同，按二项分布统计分析原理，推断该批蚕种的杂交率在95％以上，并得知这一结论的正确率(概率值)在95％以上。
取上清液30μl，加75μl99％酒精，-20℃中放置30min,12000×g、4℃离心20min，沉淀用20μl无菌去离子水溶解，作为PCR反应所需的DNA模板。
(2)PCR反应引物采用ZHD0004引物，序列为TGGATGAGACC。
(3)PCR反应条件设定PCR反应体系
上述抽提得到的DNA模板液1μlTaq DNA聚合酶2.3u10×PCR反应缓冲液(成分组成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0)5μldNTP各0.17mmol/LZHD0004引物，使终浓度为0.4μmol/L加无菌去离子水，使总体积达到50μlPCR反应条件94℃预热4min变性解链94℃ 1min复性39℃ 1.5min合成延伸72℃ 1.5min循环35次保存72℃,5min,4℃,1h。
(4)DNA电泳采用1％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用1％TAE。
(5)结果PCR反应合成的DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳分离，丰1品种具有1、2、4和5共4条带，富日品种具有1、2、3和5共4条带，丰1×富日、富日×丰1两个杂交种都具有1、2、3、4和5共5条带。两个亲本的DNA片断在两个杂交种中都存在，结果符合遗传规律。亲本与杂交种的DNA电泳图谱的特征具有明显差异，所以可用于杂交种的杂交率鉴定。100次实验结果相同，故确定这种电泳图谱为丰1、富日及其杂交种的电泳参照图谱。
实验从浙江省湖州蚕桑科学研究所繁育的蚕种丰1×富日中抽取200粒蚕卵，按上述PCR反应获得每一粒蚕卵的DNA片断，经琼脂糖电泳发现，有3粒蚕卵的DNA电泳图谱与丰1品种的电泳图谱相同，其他197粒蚕卵的DNA电泳图谱与丰1×富日品种的电泳图谱相同，按二项分布统计分析原理，推断该批蚕种的杂交率在96％以上，并得知这一结论的正确率(概率值)在95％以上。
权利要求
1．用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法，其特征在于它的方法是(1)DNA模板的提取第一步取1粒蚕卵或1条蚁蚕，加入10～100μl 0.1～1.0mol/L NaOH,0.5～2.5％ME缓冲液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl 50～200mmol/LTris-HCl pH6～9缓冲液，搅拌10min,10000～15000×g、4℃离心5～20min；第二步取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min,10000～15000×g、4℃离心5～30min，用10～100μl无菌去离子水溶解，即得到PCR反应所需的DNA模板；(2)PCR反应的引物如下随机引物，可在目前生产用蚕品种的亲本与杂交种之间形成特征性的谱带，用于杂交率的鉴定
(3)PCR反应条件PCR反应体系上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；Taq DNA聚合酶0.2～5u；按总体积1/10的量加入10倍PCR反应缓冲液，组成成分100mM/LTris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0；dNTP各0.15～0.25mmol/L；加上述DNA合成引物，使终浓度为0.1～1.5μmol/L；加无菌去离子水，使总体积达到10～100μl；PCR反应条件94～95℃预热4～5min；变性解链94℃ 0.5～2min；复性30～50℃ 0.5～2min；合成延伸70～75℃1～5min；循环30～45次；保存70～75℃,5～10min；4℃,0.5～12h；反应设备PCR反应仪；(4)DNA电泳采用0.8～1.5％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用0.5～1％TAE或TBE；(5)样本容量取100～1000粒蚕卵或蚁蚕作为样本，供杂交率鉴定用，用样本的结果推断总体的结果，正确率可达到95～99％。
全文摘要
用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法,是以蚕卵或蚁蚕为材料,以每一品种的亲本和杂交种为一个组合,分别快速提取DNA模板,与适当的DNA合成引物构成反应体系,扩增特异性的DNA片断,建立每一品种的亲本和杂交种的特征性DNA片段电泳参照图谱,作为杂交率鉴别的依据。再抽取100～1000粒的蚕卵或蚁蚕构成样本,用上述方法建立每一个体的DNA片段电泳图谱,并与参照图谱比较,判断是否是杂交种子,算出样本的杂交率。用数理统计的原理算出由样本杂交率推断总体杂交率的正确性,并设定其为95～99%。
文档编号C12Q1/68GK1311337SQ0110327
公开日2001年9月5日 申请日期2001年1月19日 优先权日2001年1月19日
发明者钟伯雄, 丁农 申请人:浙江大学, 浙江省湖州蚕桑科学研究所