Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及Cas9介导的家蚕基因编辑载体，还涉及该基 因编辑载体的应用。
【背景技术】
[0002] CRISPR/Cas9基因编辑技术是细菌和古细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的 一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制之一。是由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA，指 导Cas9核酸内切酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组或非同源末端连接，进而实现在目 的DNA上进行编辑。因为这一新系统相比以前的基因编缉系统具有制备简单、成本低、作用 高效等优点，开发后获得了快速发展等优点。因此，基于CRISPR/Cas9基因编辑技术在持续 感染的病毒或潜伏感染病毒疾病治疗中具有重大的潜在意义。
[0003]CRISPR/Cas9系统工作的基本原理是当病毒或噬菌体感染宿主细胞时CRISPR被 转录为长的RNA前体（PreRISPRRNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复 序列和间隔区的成熟〇冰熟(〇?15?1?-(1虹1代(11?熟)，最终识别并结合到与其互补的外源0嫩 序列上。并引导Cas9核酸内切酶在靶位点剪切双链DNA，随后，细胞的非同源末端连接修复 机制（NHEJ)重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变，引起靶标基因错误的 转录翻译，从而使基因丧失功能。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形 成sgRNA(single-guidedRNA)进行简化。因此，这一简化的CRISPR/Cas9基因编缉系统能 够准确、快速、直接清除入侵的外源DNA。
[0004] 家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫。BmNPV是蚕业生产上最常见的且危 害最严重的一类病原，对蚕业生产影响巨大。利用当今发展迅速的基因工程技术，从根本上 提高家蚕病毒抗性，是蚕业领域重要的研究课题。基因的敲除研究表明，缺失某些增殖必 需基因，BmNPV将不能增殖。因此，抑制这些病毒增殖必需基因的表达将成为防治家蚕感染 BmNPV的一种有效策略。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以BmNPV增殖必需基因为靶基因 而构建基因编缉载体，再将其导入家蚕细胞并持续表达能够导致BmNPV增殖必须基因发生 插入或缺失从而丧失功能，是防治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系的有效手段。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Cas9介导的家蚕基因编辑载体；本发明的 目的之二在于提供含有Cas9介导的家蚕基因编辑载体的转化子，本发明的目的之三在于 提供Cas9介导的家蚕基因编辑载体的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007]Cas9介导的家蚕基因编辑载体，包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框 U6-sgRNA和IE-1启动子调控Cas9表达的表达框。
[0008] 优选的，还包括荧光标记系统。
[0009] 更优选的，所述荧光标记系统为Mcherry红色荧蛋白。
[0010] 优选的，所述Cas9的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，表达框U6-sgRNA含有如 SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列，IE-1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0011] 更优选的，所述Mcherry红色焚蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示。
[0012] 优选的，所述Cas9由SEQ ID NO. 18所示的Hr3-39k诱导型启动子调控表达。
[0013] 优选的，所述sgRNA为egfp基因的sgRNA或ie_l基因的sgRNA;所述egfp基因 的sgRNA的核苷酸序列含有如SEQIDN0.5~10所示中的任意一条或两条；所述ie-1基 因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDN0. 11~16所示中的任意一条或两条。
[0014] 2、含有权利要求1~7任一项所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体的转化体。
[0015] 3、所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体在昆虫基因功能研究或家蚕抗BmNPV品系 基因工程育种中的应用。
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种高效、稳定的Cas9介导的家蚕基因编 辑载体，可以为组成型基因编辑载体，也可以为诱导型基因编辑载体，诱导型基因编缉载体 在昆虫细胞中更具有稳定、高效的表达，从而更好的调控靶基因的表达。能够用于制备昆虫 抗病毒转基因素材和具有尚效抗病毒的品种，用于昆虫基因功能研究和家香抗BmNPV品系 基因工程育种中的应用。
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018]图1为表达载体pSL1180-IEl-Cas9-SV40和sgRNA表达载体pIZ-U6-sgRNA示意 图；
[0019] 图2为表达载体pSL1180-IEl-Cas9-SV40转染BmN-SWUl细胞后Cas9定位示意 图；
[0020] 图3为针对外源蛋白EGFP设计的sgEGFP靶序列示意图；
[0021] 图4为不同靶序列sgEGFP基因编辑效果荧光图及蛋白表达图（A:荧光图；B:蛋白 表达图）；
[0022] 图5为靶序列为sgEGFP-339的基因编缉测序结果；
[0023] 图6为ie-1基因靶序列sgIE-1骨架结构示意图；
[0024] 图7为过表达Cas9和U6_sgRNA串联载体示意图；
[0025] 图8为过表达靶序列为sgIE-1的基因编缉载体后基因编缉效果示意图；
[0026] 图9为靶序列为sgIE-1的基因编缉测序结果；
[0027] 图10为过表达靶序列为sgIE-1后基因编缉对病毒DNA复制、蛋白表达及病毒毒 力的影响结果比较图（A:病毒DNA复制结果；B:病毒毒力结果；C:蛋白表达结果）；
[0028] 图11为稳定细胞系筛选后基因编缉载体表达不意图；
[0029] 图12为稳定细胞系抗病毒效果9?光效果和统计结果不意图（A:抗病毒效果9?光 效果；B:统计结果）；
[0030] 图13为靶序列为SgIE-1稳定细胞系基因编缉对病毒DNA复制、蛋白表达及病毒 毒力的影响结果比较；
[0031] 图14为病毒诱导型基因编缉系统表达示意图；
[0032] 图15病毒诱导型基因编缉系统病毒感染后及不同毒力病毒诱导转录和表达条件 结果比较（A:病毒感染后转录和表达结果；B:不同毒力病毒诱导转录和表达结果）；
[0033] 图16病毒诱导型基因编缉系统稳定细胞系抗病毒效果荧光效果和统计示意图 (A:荧光效果图；B:统计结果图）；
[0034] 图17病毒诱导型基因编缉系统稳定细胞系对病毒DNA复制、蛋白表达及病毒毒力 的影响结果比较。
【具体实施方式】
[0035] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0036] 实施例1、基于Cas9和U6_sgRNA为骨架的基因编缉载体构建
[0037] 登陆addgene载体数据库（http://www.addgene.org/)，下载已有的昆虫Cas9基 因和U6序列，根据家蚕密码子特征设计家蚕特异Cas9基因和U6-sgRNA序列，其序列分别 为SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示，然后送Gensript公司合成序列。
[0038] 将合成的Cas9基因序列通过ClaI和XbaI酶切位点酶切后连接到经过同样酶 切的PSL1180载体上，连接产物转化大肠杆菌大肠杆菌DH5a感受态细胞，然后用含有氨苄 青霉素（Amp)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，酶切验证正确后使用；然后在 XhoI和ClaI酶切位点处连接SEQIDNo. 3所示的IE-1启动子，在XbaI和EcoRI酶切 位点处连接SEQIDNo. 4的SV40终止信号，获得pSL1180-IEl-Cas9-SV40载体，结构如图 1所示，经过酶切验证和测序正确后使用。将XhoI和AgeI双酶切U6-sgRNA连接到经过 同样双酶切的pIZ-V5/His载体中，得pIZ-U6-sgRNA载体；然后经过同样的方法转化、挑取 阳性克隆及测序验证。
[0039] 将构建的pSL1180-IEl-Cas9-SV40载体用脂质体转染试剂转染到BmN-SWUl细胞 中，转染48小时后，用1XPBST轻洗细胞3次，每次5min，然后加入质量分数为4%的多聚 甲醛溶液，室温固定15min，用1XPBST轻洗细胞3次，每次5min;再用质量分数为0. 1%的 Triton-100通透细胞10min，用1XPBST轻洗细胞3次，每次5min;接着用封闭液（含10% 的羊