人类ptx3重组蛋白的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人类重组蛋白的制备方法，具体涉及到人类PTX3重组蛋白的制 备方法及应用。 技术背景
[0002] 五聚素3 (PTX3)是五聚素蛋白家族成员之一，属于长链五聚体蛋白。PTX3是急性 期反应蛋白的一种。研究表明，PTX3是一种可溶性病原模式识别受体（PRR)，可迅速选择性 识别入侵的外源病原体并与之结合，这是激发机体先天性免疫和继发性免疫应答，从而清 除入侵病原体的关键的第一步。同时，细胞培养和动物模型已证实，PTX3可以选择性地高亲 和力地与某些病原体，包括巨细胞病毒（CMV)，流感病毒（Influenza)，鼠肝炎病毒（MHV)， 鼠伤寒沙门菌和铜绿假单胞菌以及烟曲霉菌等结合，引起初次和二次免疫应答，刺激炎性 细胞因子表达，激活补体系统，刺激炎性细胞的吞噬功能，进而导致入侵病原体的限制与清 除，减轻病原体对身体的损伤。因此，PTX3被认为具有十分巨大临床治疗药用价值。
[0003] 2003年，始于中国的病毒感染引起的严重急性呼吸综合症（SARS)导致了全球性 的恐慌。此后，几次禽流感/猪流感大流行依然是全球公共健康最严重的威胁之一。其后， 中国出现的新型H7N9禽流感病毒，以及最近在中东与东亚流行的MERS，均有潜力成为大流 行病毒。这些病毒可从动物传染到人类，具有极高的死亡率。虽然已投入巨资，特异性抗病 毒药物的研制却并没有取得显著的进展。应用小鼠感染MHV1病毒可诱发如SARS样的急性 肺损伤模型。我们的研究证明重组表达的PTX3可直接与MHV病毒结合并显着性地抑制病 毒复制。内源性PTX3或给予重组表达的PTX3可以增强被感染的动物的病毒清除，并保护 他们免受严重的肺部损伤。其他的研究也表明内源性PTX3表达或给予外源性重组PTX3具 有抗真菌和抗细菌作用。PTX3基因敲除导致转基因小鼠对肺病毒与真菌感染的易感性增 高，给予重组表达的PTX3则恢复其对病毒与真菌感染抵抗力。提高PTX3表达水平（基因 敲入）已证明可提高动物对内毒素血症和败血症的存活率。
[0004] 利用重组DNA来表达多种生物活性的蛋白质，是一种先进的分子生物学技术， 它被广泛应用于生物和医学研究。而保证重组蛋白质具有充分的生物活性与功能的关 键则完全依赖于其合成后正确的折叠（Folding)和翻译后修饰（Posttranslational modification)例如磷酸化、二硫键的形成以及人类特异的糖基化。
[0005] 目前PTX3主要靠原核蛋白重组表达获得，虽然利用原核细胞表达重组PTX3有较 高的得率，但其因缺乏真核细胞的后期折叠修饰机制，因此其生物活性有限。而由哺乳动物 细胞表达的重组蛋白则能很好地弥补这些缺陷，使其所表达的重组蛋白具有类似于天然蛋 白的生物活性。为了表达结构修饰完善，具有高生物活性的PTX3,我们选择中华仓鼠卵巢细 胞（CH0)作为表达靶细胞，并对其进行了基因改造使之成为可长时间高密度持续培养的抗 凋亡细胞。我们还构建了含抗新霉素基因的可在哺乳动物细胞系统中表达人类PTX3重组 蛋白的DNA载体，建立了可稳定表达重组人类PTX3蛋白的哺乳动物（CH0-K1)细胞株。初 步提纯后经细胞与动物实验检测表明，重组人类PTX3蛋白具有很高的生物功能活性，对治 疗呼吸道SARS样病毒感染具有药理治疗价值。
[0006] 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了 很大进展，但是利用CH0-K1细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和 生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：
[0007] ①构建的重组CH0-K1细胞生产效率低，产物浓度亦低；
[0008] ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
[0009] ③重组CH0-K1细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重 考虑它的高效表达，而对高效表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较 少；
[0010] ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了一种人类PTX3重组蛋白的制备方法，提高了人类PTX3重组蛋白的 产出率。
[0012] 本发明提供了一种从人类的原代上皮细胞中提取携带人类PTX3蛋白信息mRNA进 而制备PTX3重组蛋白的方法。人类的原代上皮细胞类型单一极其接近自然状态，RNA酶活 性低，提取的RNA产量高，纯度高，无降解，保证了核苷酸序列的完整性，使反转录合成cDNA 的成功率大大提高。
[0013] 本发明通过重组载体转化至大肠杆菌，氨苄青霉素选择培育扩增阳性转化菌落提 取所构建的PTX3表达质粒，并以特异性内切酶消化与核苷酸测序相结合的方法确定所构 建的正确性。
[0014] 本发明提供了一种对CH0-K1细胞的内源性基因进行特异性改造，敲除其促凋亡 因子bax和bak基因的方法。建立了具有抗凋亡特性的重组CH0-K1细胞，提高了重组蛋白 表达细胞持续存活时间与细胞培养密度，有利于重组蛋白的积累，进而提高了重组蛋白产 出率。
[0015] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种人类PTX3重组蛋白的 制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0016]S1、从人类的原代上皮细胞中提取携带PTX3蛋白翻译信息的mRNA，设计特异性引 物，以所述mRNA为模板，合成cDNA，并在所述cDNA的两端分别引入限制性酶切位点BamHI 和BglII;
[0017]S2、用内切酶暴露出真核细胞表达载体pSG5上的BamHI和BglII粘性末端，将 上述带有BamHI和BglII末端的所述cDNA克隆到所述表达载体上构建pSG5/PTX3载体， 在所述PSG5/PTX3载体中插入新霉素抗性基因，构建重组载体pSG5/neo/PTX3 ;
[0018]S3、将所述重组表达载体转化至大肠杆菌中，用氨苄青霉素培养基筛选出阳性菌 落，扩增阳性转化菌落，提取所述重组载体进行测序鉴定；
[0019]S4、敲除CH0-K1细胞中Bax和Bak基因，得到具有抗凋亡特性的目标细胞并冷藏；
[0020] S5、以纯化并测序鉴定后的所述重组载体转染所述目标细胞中以得到表达细胞， 培育并筛选稳定高产的PTX3重组蛋白表达细胞株，从所述表达细胞的培养液中富集并纯 化人类PTX3重组蛋白。
[0021] 优选地，对所述CH0-K1细胞进行基因敲除的步骤具体包括：
[0022] S41、合成编码Bak锌指蛋白的第一基因和编码Bax锌指蛋白的第二基因，并分别 与非特异性核酸内切酶基因FokI杂合；
[0023]S42、将所述第一基因、第二基因以及所融合的非特异性核酸内切酶FokI基因片 段一并插入带有抗卡那霉素基因的PVAX1载体中，构建特异性内源性基因敲除载体；
[0024]S43、将所述特异性内源性基因敲除载体转入所述CH0-K1细胞中，所述转染的 CH0-K1细胞表达的所述带有非特异性核酸内切酶FokI的Bak锌指蛋白和Bax锌指蛋白， 分别特异性的锚定到所述CH0-K1细胞自身的Bak和Bax基因，进而敲除所述促凋亡因子， 得到所述目标细胞。
[0025] 优选地，所述步骤S4中所述目标细胞转染所述重组载体之前还包括以下步骤：
[0026]S44、在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10%的胎牛血清的F12 培养液培养于24孔板中；
[0027]S45、在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养液的同时丢弃一半数目的 所述目标细胞，使用由CD-CH0无血清培养液和含有体积分数为10 %的胎牛血清的F12培养 液组成的混合培养液培养，其中所述混合培养液中的胎牛血清的体积分数每天递减2 %，直 至为〇，在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，每孔装有2mL的所述目标细胞 悬浮液。
[0028]优选地，所述F12 培养液中添加 4. 76g/L的HEPES和 125mg/LL-glutamine。
[0029] 优选地，所述6孔板中每孔细胞数为2. 7 X 105个。
[0030] 优选地，所述步骤S5中所述目标细胞转染所述重组载体之后，表达细胞的筛选培 育具体步骤如下：
[0031]S51、将所述重组载体转染的目标细胞转移至T25培养瓶中，并在培养液中添加 700yg/mL的G418;
[0032] S52、待表达细胞在含有700yg/mLG418的培养液中扩增至培养瓶底面积的80% 时，将一瓶中的所述表达细胞均分至3瓶培养，并将培养液中G418的浓度减少至200yg/ mL；
[0033]S53、待表达细胞繁殖融合至培养瓶底面积的50%时，将这3瓶中的细胞汇总并记 录细胞的总数。
[0034] 优选地，所述步骤S5中筛选表达细胞具体包括以下步骤：
[0035]S54、取步骤S53中的经G418选择培养的阳性表达细胞进行序列稀释后培养于3 块96孔培养板上，每个孔加200yL细胞悬液约含5个表达细胞；待细胞繁殖融合至底面积 1/3时，取上清做PTX3Dot-Blot检测，选择PTX3强阳性孔的细胞集落进行再次亚克隆筛 选；
[0036]S55、待亚克隆细胞融合度达底面积1/3时，取细胞上清液重复PTX3Dot-Blot检 测，挑选强阳性的细胞克隆做进一步筛选扩增，如此反复进行多次筛选，直至所有细胞克隆 孔的上清培养液PTX3Dot-Blot检测均达强阳性后，再次从亚克隆培养板中以Dot-Blot的 阳性强度挑选数株阳性强度最高的