HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及HNP蛋白，具体涉及一种HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 感染性疾病，包括细菌，病毒和真菌感染，是世界各国临床病人死亡的主要原因之 一。特别是在包括中国在内的发展中国家中尤为严重，是全球公共健康最严重的威胁之一。 另一方面，尽管作为抗感染的主要工具的抗生素已广泛应用，但细菌感染的发病率和死亡 率仍然居高不下。抗生素在临床实践和其他领域如农业和粮食生产中的滥用更导致大量多 重耐药微生物的出现。据报道，在美国70%的感染至少对一种抗生素药物有抗药性。感染 及传染性疾病不仅是一个严重的医疗问题，同时也造成了沉重巨大的经济负担，进而对全 球的政治，经济和社会产生了巨大的影响。显然，探索新的具有不同杀菌机制的抗菌药物来 治疗感染性疾病有着巨大而迫切的需求。近年来，人类的天然抗菌肽（AMPS)作为一类新型 抗生素，备受关注。
[0003] 防御素是富含半胱氨酸的小阳离子蛋白和人类的主要天然抗菌肽（AMPS)之一。 作为宿主防御肽，它们的功能在人类先天免疫中发挥了关键作用。a-防御素是人类防御素 的一种主要类型，人类嗜中性粒细胞肽（Human neutrophil peptides 1，HNP-1)是a-防 御素主要组成成分。HNP-1是人类最丰富而重要的防御肽储备，主要表达在人类中性粒细 胞中，占细胞中总蛋白的5%，嗜天青颗粒细胞内总蛋白50%以上。a-防御素具有广谱的 杀灭革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和许多有包膜病毒和非包膜病毒效果。与其他类 抗生素相比，a-防御素代表了一类新的抗生素。a-防御素的优势是采取了完全不同的 杀菌机制，直接攻击微生物胞壁，并导致微生物死亡。因此，对于这类抗生素，目标微生物不 太可能产生耐药性。a-防御素水平在健康受试者体内是相当低的。已知局部和循环水平 a _防御素的显著增加与肺中性粒细胞的数目升高及病原体局部浸入有关联。常常出现在 感染和炎症性疾病中，如急性呼吸窘迫综合征（ARDS)，败血症，肺炎，肺结核，肺移植和慢性 阻塞性肺疾病（C0PD)等，表明a-防御素在炎症性疾病的发病机理中起着重要作用。有新 的证据表明a-防御素可作为新的生物标志物用于感染和炎症性疾病诊断和预后判断。
[0004]目前HNP主要靠天然纯化，化学合成或者细菌表达获取。天然纯化因其来源有限， 无法商品化大量应用。化学合成则价格昂贵且生物活性很低。细菌表达的重组蛋白，虽然具 有天然多肽的氨基酸序列，但由于缺乏适当的哺乳细胞内表达翻译后的蛋白折叠与修饰， 所以其活性均不及天然蛋白，而且生产成本高，产量低，易污染。
[0005] 在过去几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很 大进展，但是利用CH0-K1细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生 产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：
[0006] ①构建的重组CH0-K1细胞生产效率低，产物浓度亦低；
[0007] ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
[0008] ③重组CH0-K1细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重 考虑它的高效表达，而对高效表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较 少；
[0009] ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的是提供一种具有抗菌活性的HNP-1-Fc重组蛋白结构构成。
[0011] 本发明还有一个目的是提供一种具有高产出率的HNP-1-Fc重组蛋白的制备方 法。
[0012] 本发明构建的哺乳动物细胞表达载体中含有全长HNP-lcDNA和部分人类IgG2_Fc cDNA片段，所表达的为重组的HNP-1-Fc蛋白。
[0013] 为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种HNP-1-Fc重组蛋白的制备 方法，所述方法包括以下步骤：
[0014]S1、从人的单克隆抗体细胞中提取携带hlgG2_Fc蛋白翻译信息的mRNA，以所述 mRNA为模板合成cDNA;
[0015]S2、合成携带hGHRH蛋白翻译信息的cDNA片段，并与步骤S1合成的cDNA连接，形 成hGHRH/hIgG2-Fc基因克隆片段；
[0016]S3、合成包含Flag的HNP-1的cDNA片段：Flag/HNP-1，与步骤S2合成的基因克隆 片段连接，形成hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-l基因克隆片段，将其定向克隆至真核细胞重组 载体PMPGCR5B上，构建表达载体；
[0017]S4、将所述表达载体转化至大肠杆菌中，用含有氨苄青霉素培养基筛选出阳性转 化菌落，扩增阳性转化菌落并提取表达载体，并对表达载体进行酶切和测序鉴定，对测序后 的表达载体进行纯化；
[0018]S5、以纯化后的表达载体转染哺乳细胞CH0-K1中以得到表达细胞；
[0019]S6、从所述表达细胞的培养基中纯化出HNP-1-Fc重组蛋白。
[0020] 优选地，步骤S5中将所述重组载体转染所述目标细胞之前还包括以下步骤：
[0021 ] 在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10 %的胎牛血清的F-12培养 基培养于24孔板中；
[0022] 在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养基的同时丢弃一半数目的所述 目标细胞，并用〇10-3-3?1111培养基与含有10%的胎牛血清的？-12培养基组成的混合培 养基培养，在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，应用CHO-S-SFMII作无血 清培养，其中所述6孔板的每孔装有2mLCHO-S-SFMII培养基。
[0023] 优选地，在转染前6天至转染前1天的期间，所述混合培养基中的含有10%的胎牛 血清的F-12培养基的比重由100 %每天递减20%，直至0。
[0024] 优选地，所述步骤S6中纯化HNP-1-Fc重组蛋白的具体步骤包括：
[0025]S61、将表达细胞的上清液加入亲和层析柱，置静音混匀器翻转混匀反应2-4小 时，收集穿透液；
[0026]S62、使用冲洗液冲洗所述上清液中未结合组分，以G250蛋白染色液检测直至将 柱床冲洗干净；
[0027]S63、向所述层析柱内加入洗脱液洗脱，用G250蛋白染色液鉴定是否有蛋白洗脱 下来，当出现蛋白时，用5mL离心管收集蛋白，直到G250蛋白染色液显示为无色，说明无HNP-1-Fc重组蛋白流出时为止，其中每根离心管加250yL1MTris?HC1缓冲液中和；
[0028]S64、根据洗脱时G250蛋白染色液的颜色确定HNP-1-Fc重组蛋白所在的离心管， 合并这些离心管内的重组蛋白。
[0029] -种HNP-1-Fc重组蛋白在制备抗肺炎药物中的应用。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 1、构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达目的蛋白的基因质粒。
[0032] 2、通过重组表达载体的大肠杆菌转化，氨苄青霉素培养基筛选扩增阳性菌落，可 以迅速提取纯化表达载体，并对表达载体进行酶切和测序鉴定。
[0033] 3、敲除促凋亡因子bax和bak基因改造过的CH0-K1细胞，持续存活时间延长，细 胞培养密度增高，有利于重组蛋白的积累，产量增高。通过抗生素筛选以及培养基条件的改 进，建立起产量高，表达稳定，适合悬浮培养的细胞株储备库。初选出来的细胞株的HNP蛋 白产量>l〇mg/L。
[0034] 4、引入hIgG2_Fc片段的HNP-1重组蛋白具有与天然蛋白同等的生物活性，不受引 入的hIgG2-Fc片段影响。初试结果显示，与纯化的天然蛋白对比，HNP-1-Fc重组蛋白对细 菌的杀灭与对人类上皮细胞粘附性的增强作用均无明显差异。
[0035] 5、HNP-1-Fc重组蛋白具有如下优势：a、增强蛋白稳定性，延长循环时间；b、增强 与靶细胞（病原菌等）的亲和力，提高杀菌效果；c、降低产物的免疫原性；d、便于产物提取 纯化，适用于大批量重组蛋白粗产品的一步性提取纯化。利用HNP-1-Fc重组蛋白Fc片段， 通过ProteinA亲和层析柱一步法使融合有hIgG2-Fc的HNP-1重组蛋白挂柱洗脱，可以一 次大批量地提取纯化重组蛋白产物。初试显示，应用该法重组蛋白回收率达到72%，纯度达 到 95%。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明所述的重组蛋白表达载体的构建流程图；
[0037] 图2为本发明所述的HNP-1-Fc重组蛋白的灭菌活性检测结果图；
[0038] 图3为本发明所述的HNP-1/Fc重组蛋白对上皮细胞粘附性影响结果图；
[0039] 图4为本发明所述的HNP-1/Fc重组蛋白纯化结果检测图；
[0040] 图5为本发明所述的HNP-1/Fc重组杂交蛋白上分离HNP-1检测图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0042] 本发明提供了一种HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0043]S1、从人的单克隆抗体细胞中提取携带hlgG2_Fc蛋白翻译信息的mRNA，以所述 mRNA为模板合成cDNA;
[0044]S2、合成携带hGHRH蛋白翻译信息的cDNA片段，并与步骤S1合成的cDNA连接，形 成hGHRH/hIgG2-Fc基因克隆片段，hGHRH蛋白是一种生长激素刺激激素，能够帮助细胞分泌 重组蛋白，重组蛋白表达完后，能够自动离开，类似信号肽的作用；
[0045]S3、合成包含Flag的HNP-1的cDNA片段：Flag/HNP-1，与步骤S2合成的基因克 隆片段连接，形成hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-l基因克隆片段，将其定向克隆至真核细胞重 组载体PMPGCR5B上，构建表达载体；；所述真核细胞载体有7832bp，含有较多酶切位点， 可帮助外源基因克隆入载体；该载体含有CMV启动子，可促进外源基因的表达；载体含有 Hygromycin