用于增加的重组蛋白产生的制剂和方法
【专利说明】用于增加的重组蛋白产生的制剂和方法
[0001]相关申请
本申请要求2013年2月 26 日提交的题为“FORMULAT1NS AND METHODS FOR INCREASEDRECOMBINANT PROTEIN PRODUCT1N”(代理人案卷号 BHC125022US (BH-023/L))的美国临时专利申请序列号61/769，402的优先权，所述申请在此出于所有目的以其整体通过引用并入本文。
[0002]背景
细胞培养系统可用于在包括营养物以促进细胞生长的细胞培养基制剂中产生重组蛋白。实例细胞培养基制剂包括DMEM/F12、RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES细胞基础培养基、L-15、頂DM、McCoy氏5A培养基和VeroPlus SFM。
[0003]在重组蛋白的生产，包括商业生产中，期望增加重组蛋白生产的水平，同时保持产物质量。
[0004]因此，需要增加重组蛋白生产而不降低产物的质量的细胞培养基制剂和方法。
[0005]概述
在一些实施方案中，提供哺乳动物细胞培养基制剂。所述制剂具有约3.5 g/L或更多的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者。
[0006]在一个或多个实施方案中，提供在细胞培养物中产生重组蛋白的方法。所述方法包括在细胞培养基中培养表达重组蛋白的细胞，所述细胞培养基具有约3.5 g/L或更多的甘露糖和重组蛋白的稳定剂诸如约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者。在某些实施方案中，所述方法导致重组蛋白的产生的增加。在某些实施方案中，所述方法导致重组蛋白的产生的增加，而不妥协产生的重组蛋白的质量。
[0007]根据这些和其他实施方案提供许多其他方面。本文记载本教导的这些和其他特征。
[0008]附图
技术人员会理解下文描述的附图是仅用于说明目的。附图不是意在以任何方式限制本教导的范围。
[0009]图1是说明根据多个实施方案增加细胞培养系统中的重组蛋白产生的方法的流程图。
[0010]图2图示显示根据多个实施方案甘露糖浓度从3克/升(“g/L”)增加至5 g/L使1L灌注生物反应器细胞培养中的重组人因子VIII ( “rhFVIII”)滴度增加25%。
[0011]图3图示显示根据多个实施方案甘露糖浓度从3 g/L增加至5 g/L使15L灌注生物反应器细胞培养中的rhFVIII滴度增加~37%。
[0012]图4图示显示表明根据多个实施方案对滚管(重复分批)实验中5毫摩尔(“mM”)氯化钙的测试条件的rhFVIII滴度(~19%增加)的最高影响的结果。
[0013]图5图示显示根据多个实施方案钙浓度从1 mM增加至5 mM使1L灌注生物反应器细胞培养中的rhFVIII滴度增加~27%。
[0014]图6图示显示根据多个实施方案钙浓度从1 mM增加至5 mM使15L灌注生物反应器细胞培养中的rhFVIII滴度增加~29%。
[0015]图7A-B图示显示根据多个实施方案从对照培养基(含有ImM氯化钙和3 g/L甘露糖)切换至针对两种组分富集的培养基(含有5mM氯化钙和5 g/L甘露糖)使rhFVIII滴度增加29%且效果是可逆的结果。
[0016]图8A-B显示根据多个实施方案15L灌注生物反应器活动(A)和所得效价数据(B)的设计。
[0017]图9图示显示根据多个实施方案操纵细胞培养制剂的糖含量对rhFVIII的生产水平的结果，显示使用含有甘露糖的培养基和不含甘露糖的培养基的效价的平均值。
[0018]多个实施方案的描述
如所述，增加细胞培养基制剂中培养的表达蛋白的细胞的生产水平、而不会不利影响蛋白产物质量是一种挑战。根据本文描述的一个或多个实施方案，通过向细胞培养基提供额外的营养物诸如甘露糖和/或稳定剂诸如钙，可以生成改善的细胞培养基制剂。在一些实施方案中，改善的细胞培养基制剂可以增加使用细胞培养基制剂培养的表达蛋白的细胞的生产水平，而对产物质量具有很少影响或没有可检测的影响。还提供形成和/或使用此类细胞培养基制剂的方法。
[0019]实例细胞培养基制剂
如上所述，在多个实施方案中，可以通过增加制剂中甘露糖的浓度和/或重组蛋白的稳定剂诸如钙的浓度或两者而实现细胞培养基制剂中重组蛋白产生的增加。
[0020]在一个方面，提供细胞培养基制剂(例如，细胞培养基组合物)，其包括约3.5 g/L或更多(或者，在某些实施方案中，约4 g/L、约5 g/L、约6 g/L或约7 g/L或更多)的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM或更多(或者，在某些实施方案中，以约2 mM、约3 mM、约4mM、约5 mM、约6 mM、约7 mM、约8 mM、约9 mM或约9.5 mM或更多)范围内的I丐中的至少一者。可以采用其他细胞培养基制剂。
[0021]在添加约3.5 g/L或更多的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者之前，细胞培养基制剂可以是任何细胞培养基制剂。例如，在某些实施方案中，细胞培养基制剂可以包括合适比率诸如1:1的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基和Ham氏F-12营养混合物(DMEM/F12)，和约5 g/L的甘露糖和约5 mM的钙中的至少一者。
[0022]可以采用其他细胞培养基制剂代替DMEM/F12诸如RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES细胞基础培养基、L-15JMDM、McCoy氏5A培养基和VeroPlus SFM。在某些实施方案中，所述细胞培养基制剂用于培养哺乳动物细胞。
[0023]本文提供的实例细胞培养基制剂包括但不限于:
(a)约3.5 g/L或更多的甘露糖和小于约1.5 mM或大于约9.5 mM的|丐；
(b)小于约3.5 g/L的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙；
(c)约4g/L至约5 g/L范围内的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者；
(d)约5g/L的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者；
(e)约4g/L至约5 g/L范围内的甘露糖和小于约1.5 mM或大于约9.5 mM的|丐；
(f)约5g/L的甘露糖和小于约1.5 mM或大于约9.5 mM的|丐；
(g)约3.5 g/L或更多的甘露糖和约2 mM至约5 mM范围内的钙中的至少一者； (h)约3.5 g/L或更多的甘露糖和约5 mM的钙中的至少一者；
(i)小于约3.5 g/L的甘露糖和约2 mM至约5 mM范围内的钙；
(j)小于约3.5 g/L的甘露糖和约5 mM的钙；和/或
(k) 1:1比率的DMEM/F12，和约5 g/L的甘露糖和约5 mM的钙中的至少一者。
[0024]可以采用其他制剂。
[0025]形成/使用细胞培养基制剂的方法
现在将参考下面图1-8描述在细胞培养中产生重组蛋白的方法。
[0026]图1说明根据本文提供的某些实施方案在细胞培养中产生重组蛋白的方法100的流程图。参考图1，方法100开始于方框101，其中提供表达重组蛋白的细胞。
[0027]实例表达重组蛋白的细胞可以包括，例如，任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、细菌细胞等。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。实例哺乳动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、肾和B细胞的杂交物(HBK)细胞、人胚肾(HEK)细胞和NS0细胞。
[0028]表达重组蛋白的细胞可以是产生任何生物蛋白产物的任何细胞。例如，所述细胞可以是经工程改造以表达一种或多种重组蛋白产物的重组细胞；和/或表达抗体分子的重组细胞。
[0029]表达重组蛋白的细胞的产物可以是任何蛋白产物，包括重组蛋白产物诸如凝血因子(凝血途径中的蛋白)，包括例如因子VI1、因子VII1、因子IX和因子X。例如，表达重组蛋白的细胞可以是表达因子VIII的哺乳动物细胞。
[0030]因子VIII可以是因子VIII的变体，诸如遗传变体，其可以通过对rFVIII基因构建体进行遗传变异而生成，导致，例如，B结构域缺失的因子VIII和突变的因子VIII。因子VIII变体包括，例如，表达后修饰的因子VIII的变体，诸如，例如，聚乙二醇化的FVIII和具有共价连接的聚乙二醇(PEG)的FVIII。因子VIII变体也可以包括具有共表达结合元件的融合蛋白。
[0031 ] 在某些实施方案中，表达重组蛋白的细胞的重组蛋白产物可以是糖蛋白。在一些实施方案中，重组蛋白是分泌的。可以采用用于形成表达重组蛋白的重组细胞的任何合适的来源和/或方法。
[0032]在方框102中，在细胞培养基制剂(即，组合物)中培养表达重组蛋白的细胞，所述细胞培养基制剂(即，组合物)包括约3.5 g/L或更多的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者。如本文所使用，细胞培养基可以包括组织或细胞培养液，一种或多种组织或细胞培养基，等。
[0033]在添加约3.5 g/L或更多的甘露糖和约1.5 mM至约9.5 mM范围内的钙中的至少一者之前，细胞培养基制剂可以是任何细胞培养基制剂。例如，在某些实施方案中，细胞培养基制剂可以包括合适比率诸如1:1的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基和Ham氏F-12营养混合物(DMEM/F12)，和约5 g/L的甘露糖和约5 mM的钙中的至少一者。
[0034]可以采用其他细胞培养基制剂代替DMEM/F12诸如RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES细胞基础培养基、L-15JMDM、McCoy氏5A培养基和VeroPlus SFM。在某些实施方案中，所述细胞培养基制剂用于培养哺乳动物细胞。
[0035]在多个实施方案中，细胞培养基制剂可以是基于Sigma-Aldrich Fine Chemicals(SAFC, Lenexa, Kansas)或Life Technologies (Grand Island, N.Y.)制造的市售DMEM/F12制剂且补充其他补充剂诸如铁、普朗尼克(Pluronic) F-68或胰岛素的培养基组合物，并且可以基本上不含其他蛋白。可以采用其他基础培养基组合物。
[0036]可