一种磁珠分离制备骨多肽的方法
【专利摘要】本发明提供一种骨多肽的制备方法，采用磁珠表面包被壳多糖后，经柠檬酸处理可与样品中的多肽类物质特异性结合，通过外加磁场，磁珠与多肽被一起吸附而滞留在磁场中，从而达到多肽的快速富集与分离，可以解决其他纯化方法所遇到的问题，并且能够大量快速的从动物骨骼酶解液中选择性提取多肽，所得产品为白色几无腥味，含氮量高。
【专利说明】
一种磁珠分窝制备骨多化的方法
技术领域
[0001] 本发明设及保健食品领域，特别设及一种磁珠分离制备骨多肤的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来生物活性肤结构和功能研究再现高潮，促进了多肤营养的发展与概念更 新，饮食中的多肤除了作为营养物具有促进机体新陈代谢、生长发育功能外，还赋予调节机 体生理功能和免疫力的双重功能。因此，多肤产品已经成为人体健康的重要物质，受到广大 消费者的青睐。
[0003] 现阶段开发的产品主要集中在海洋鱼低聚肤、鸡头骨多肤等产品，其基本方法是 将动物鲜骨在高溫、高压下蒸煮脱脂后，加入蛋白酶制剂对骨液酶解，酶解后得小分子多肤 物质。然而，运些多肤产品虽然具有良好的功效，但是，目前制备骨肤产品的工艺主要采用 提取活性成分后加热酶解后喷雾干燥得到产品，采用的纯化手段是色谱法或者有机溶剂萃 取等，缺点是难W大规模制备、环境污染、无法完全避免混入脂肪等杂质影响多肤产品的品 质。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种得到高纯骨多肤的方法，其特征在于使用磁珠分离法， 通过吸附反吸附配合，选择性提取酶解液中的多肤类物质。解决目前生产骨多肤产品中含 有脂肪等非多肤类杂质缺点。 阳〇化]本发明为实现上述目的所采用的的技术方案为：
[0006] 选择性分离多肤磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入磁珠重量1-5倍的壳聚 糖醋酸溶液，揽拌10分钟至60分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠重量1-10倍的巧樣酸钢 水溶液，剧烈揽拌下室溫反应30分钟至60分钟，去掉上清液，用与磁珠重量1-3倍的清水 洗涂磁珠 Ξ次，备用；
[0007] 多肤的吸附：在制备好的骨多肤酶解液中加入步骤（1)中制备好的磁珠，磁珠用 量占骨重量5~10%，揽拌0. 5至2小时，外加磁场将磁珠固定于反应蓋底部，除去上清液， 再用纯净水洗磁珠3次；
[0008] 多肤的反吸附：向反应蓋加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸揽拌，然后通过磁场将 磁珠固定于反应蓋底部，吸取上清液，得多肤溶液；
[0009] 喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口溫度150-160°c，出风口 70-80°C， 既得骨多肤粉。
[0010] 本发明步骤似所用骨酶解液按如下操作制备：
[0011] 活性成分的提取：取清洗好的动物骨骼，破碎成1~8cm左右的碎块，称取1单位 重量的碎骨加至反应蓋中，加入3-5单位重量的水，控制体系溫度在lore至110°C，压力为 0. 2MPa至IMPa ;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；
[0012] 酶解：将收集的水层置于反应蓋中，加入酶，控制溫度为35°C至45°C，抑值为 6. ο~7. ο ;6至8小时后加热至90°C保持15分钟，停止加热；将酶解液离屯、取上清液加入 0. 1 %单位的活性炭揽拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
[0013] 酶解步骤所用的酶为膜蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白 酶、弹性蛋白酶中的一种或多种。所述酶的用量为骨骼重量的0. 1~0.5%。优选为木瓜蛋 白酶和风味蛋白酶，所述木瓜蛋白酶的用量为骨骼重量的0. 1~0. 2%，优选0. 15%。所述 风味蛋白酶的用量为骨骼重量的0. 3~0. 5%，优选0. 4%。
[0014] 本发明采用磁珠表面包被壳多糖后，经巧樣酸处理可与样品中的多肤类物质特异 性结合，通过外加磁场，磁珠与多肤被一起吸附而滞留在磁场中，从而达到多肤的快速富集 与分离，可W解决其他纯化方法所遇到的问题。并且能够大量快速的从动物骨骼酶解液中 选择性提取多肤，所得产品为白色几无腥味，含氮量高。
【具体实施方式】 阳〇1引对比实施例1
[0016] 骨多肤酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1~8cm左右的碎块，称取1单 位重量的碎骨加至反应蓋中，加入3-5单位重量的水，控制体系溫度在lore至110°C，压力 为0. 2MPa至IMPa ;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于 反应蓋中，加入骨骼重量0. 2 %的木瓜蛋白酶，控制溫度为35 °C至45 °C，抑值为6. 0~7. 0 ; 6至8小时后加热至90°C保持15分钟，停止加热；将酶解液离屯、取上清液加入0. 1 %单位 的活性炭揽拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
[0017] 色谱法分离：将制备好的牛骨多肤酶解液500mL通过装有大孔树脂的色谱柱，收 集滤液；
[0018] 喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口溫度150-160°C，出风口 70-80°C， 既得多肤粉。
[0019] 对比实施例2
[0020] 骨多肤酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1~8cm左右的碎块，称取1单 位重量的碎骨加至反应蓋中，加入3-5单位重量的水，控制体系溫度在lore至11(TC，压力 为0. 2MPa至IMPa ;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于 反应蓋中，加入骨骼重量0. 5 %的风味蛋白酶，控制溫度为35 °C至45 °C，抑值为6. 0~7. 0 ; 6至8小时后加热至90°C保持15分钟，停止加热；将酶解液离屯、取上清液加入0. 1 %单位 的活性炭揽拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
[0021] 有机溶剂提取法脱脂：将取100血酶解液蒸干，加100血正己烧揽拌30分钟，过滤 收集滤饼；将滤饼烘干，加水溶解，离屯、取上清液；
[0022] 喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口溫度150-160°C，出风口 70-80°C， 既得多肤粉。 阳〇2引实施例1
[0024] (1)选择性分离多肤磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠 3倍质量体 积比的用1 %的醋酸溶解的壳聚糖溶液，揽拌15分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠5倍质 量体积比的10%的巧樣酸钢水溶液，剧烈揽拌下室溫反应30分钟，去掉上清液，用与磁珠1 倍质量体积比的清水洗涂磁珠 Ξ次备用；
[0025] 似多肤的吸附：将制备好的牛骨多肤酶解液加入牛骨重量10%按步骤1中制备 好的磁珠，揽拌2小时，通过磁场将磁珠固定于反应蓋底部，除去上清液，再用纯净水洗磁 珠3次；
[00%] (3)多肤的反吸附：向反应蓋加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸揽拌，然后通过磁 场将磁珠固定于反应蓋底部，吸取上清液，得多肤溶液；
[0027] (4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口溫度150-160°C，出风口 70-80°C，既得多肤粉。
[0028] 步骤（2)骨多肤酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1~8cm左右的碎块， 称取1单位重量的碎骨加至反应蓋中，加入3-5单位重量的水，控制体系溫度在lore至 ll〇°C，压力为0. 2MPa至lMPa;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集 的水层置于反应蓋中，加入骨骼重量0. 2 %的木瓜蛋白酶，控制溫度为35°C至45°C，抑值为 6. 0~7. 0 ;6至8小时后加热至90°C保持15分钟，停止加热；将酶解液离屯、取上清液加入 0. 1 %单位的活性炭揽拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
[0029] 实施例2
[0030] (1)选择性分离多肤磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠5倍质量体 积比的用3%的醋酸溶解的壳聚糖溶液，揽拌60分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠10倍质 量体积比的8%的巧樣酸钢水溶液，剧烈揽拌下室溫反应30分钟，去掉上清，用与磁珠3倍 质量体积比的清水洗涂磁珠 Ξ次备用；
[0031] 似多肤的吸附：将制备好的牛骨多肤酶解液加入牛骨重量7%按步骤1中制备好 的磁珠，揽拌1小时，外加磁场将磁珠固定于反应蓋底部，除去上清液，再用纯净水洗磁珠3 次；
[0032] (3)多肤的反吸附：向反应蓋加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸揽拌，然后通过磁 场将磁珠固定于反应蓋底部，吸取上清液，得多肤溶液；
[003引 （4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口溫度150-160°C，出风口 70-80°C，既得多肤粉。
[0034] 步骤（2)骨多肤酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1~8cm左右的碎块， 称取1单位重量的碎骨加至反应蓋中，加入3-5单位重量的水，控制体系溫度在lore至 ll〇°C，压力为0. 2MPa至lMPa;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集 的水层置于反应蓋中，加入骨骼重量0. 5 %的风味蛋白酶，控制溫度为35 °C至45 °C，抑值为 6. 0~7. 0 ;6至8小时后加热至90°C保持15分钟，停止加热；将酶解液离屯、取上清液加入 0. 1 %单位的活性炭揽拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。 阳0对 实施例3
[0036] (1)选择性分离多肤磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠5倍质量体 积比的用3 %的醋酸溶解的壳聚糖溶液，揽拌30分钟，去掉上清，然后加入与磁珠10倍质量 体积比的15%的巧樣酸钢水溶液，剧烈揽拌下室溫反应30分钟，去掉上清，用与磁珠3倍质 量体积比的清水洗涂磁珠 Ξ次备用；
[0037] 似多肤的吸附：将制备好的牛骨多肤酶解液加入牛骨重量10%按步骤1中制备 好的磁珠，揽拌1小时，外加磁场将磁珠固定于反应蓋底部，除去上清液，再用纯净水洗磁 珠3次；
[0038] (3)多肤的反吸附：向反应蓋加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸揽拌，然后通过磁 场将磁珠固定于反应蓋底部，吸取上清液，得多肤溶液；
[0039] (4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口溫度150-160°C，出风口 70-80°C，既得多肤粉。
[0040] 所得产品色泽白色，几乎无腥味，口感好于实施例1和2。
[0041] 步骤（2)骨多肤酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1~8cm左右的碎块， 称取1单位重量的碎骨加至反应蓋中，加入3-5单位重量的水，控制体系溫度在lore至 ll〇°C，压力为0. 2MPa至IMPa ;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收 集的水层置于反应蓋中，加入骨骼重量0. 15 %的风味蛋白酶和骨骼重量0. 4%的木瓜蛋白 酶，控制溫度为35°C至45°C，抑值为6. 0~7. 0 ;6至8小时后加热至90°C保持15分钟，停 止加热；将酶解液离屯、取上清液加入0. 1 %单位的活性炭揽拌15min，超滤除去活性炭，收 集酶解液，即得。 阳0创实施例4
[0043] (1)选择性分离多肤磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠5倍质量体 积比的用3%的醋酸溶解的壳聚糖溶液，揽拌30分钟，去掉上清，然后加入与磁珠10倍质 量体积比的12%的巧樣酸钢水溶液，剧烈揽拌下室溫反应30分钟，去掉上清，用与磁珠1-3 倍质量体积比的清水洗涂磁珠 Ξ次备用；
[0044] (2)多肤的吸附：将制备好的猪骨多肤酶解液加入猪骨重量10%按步骤1中制备 好的磁珠，揽拌1小时，外加磁场将磁珠固定于反应蓋底部，除去上清液，再用纯净水洗磁 珠3次；
[0045] (3)多肤的反吸附：向反应蓋加入猪骨质量相等的纯净水，煮沸揽拌，然后通过磁 场将磁珠固定于反应蓋底部，吸取上清液，得多肤溶液；
[0046] (4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口溫度150-160°C，出风口 70-80°C，既得多肤粉。
[0047] 步骤似骨多肤酶解液的制备：取清洗好的猪骨，破碎成1~8cm左右的碎块， 称取1单位重量的碎骨加至反应蓋中，加入3-5单位重量的水，控制体系溫度在lore至 ll〇°C，压力为0. 2MPa至IMPa ;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收 集的水层置于反应蓋中，加入骨骼重量0. 15 %的风味蛋白酶和骨骼重量0. 4%的木瓜蛋白 酶，控制溫度为35°C至45°C，抑值为6. 0~7. 0 ;6至8小时后加热至90°C保持15分钟，停 止加热；将酶解液离屯、取上清液加入0. 1 %单位的活性炭揽拌15min，超滤除去活性炭，收 集酶解液，即得。
[0048]
【主权项】
1. 一种骨多肽的制备方法，包括以下步骤： (1) 选择性分离多肽磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入磁珠重量1-5倍的壳聚 糖醋酸溶液，搅拌10分钟至60分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠重量1-10倍的柠檬酸钠 水溶液，剧烈搅拌下室温反应30分钟至60分钟，去掉上清液，用与磁珠重量1-3倍的清水 洗涤磁珠三次，备用； (2) 多肽的吸附：在制备好的骨多肽酶解液中加入步骤（1)中制备好的磁珠，磁珠用量 占骨重量5~10%，搅拌〇. 5至2小时，外加磁场将磁珠固定于反应釜底部，除去上清液，再 用纯净水洗磁珠3次； (3) 多肽的反吸附：向反应釜加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸搅拌，然后通过磁场将 磁珠固定于反应釜底部，吸取上清液，得多肽溶液； (4) 喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，得骨多肽。2. 根据权利要求1所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述的骨多肽酶 解液采用如下方式制备：取清洗好的动物骨骼，破碎成1~8cm左右的碎块，称取1单位重 量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在lore至110°C，压力为 0. 2MPa至IMPa ;8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反 应釜中，加入酶，控制温度为35°C至45°C，pH值为6. 0~7. 0 ;6至8小时后加热至90°C保 持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0. 1 %单位的活性炭搅拌15min，超滤除 去活性炭，收集酶解液，即得。3. 根据权利要求2所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述酶为胰蛋白酶、木瓜蛋 白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、弹性蛋白酶中的一种或多种。4. 根据权利要求3所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述酶的用量为骨骼重量 的 0· 1 ~0· 5%〇5. 根据权利要求3所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述的酶为木瓜蛋白酶和 风味蛋白酶。6. 根据权利要求5所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的用量为 骨骼重量的〇. 1~〇. 2%，所述风味蛋白酶的用量为骨骼重量的0. 3~0. 5%。7. 根据权利要求6所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的用量为 骨骼重量的〇. 15%，所述风味蛋白酶的用量为骨骼重量的0. 4%。8. -种骨多肽，其特征在于，该骨多肽采用权利要求1至7任一权利要求所述的方法制 备而得。
【文档编号】A23J3/04GK105876075SQ201410856321
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月28日
【发明人】林波, 于秀玲, 明跃升, 赵海娜, 韩风雨, 孔新颖, 李洪泽
【申请人】内蒙古天奇生物科技有限公司, 内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司, 赤峰陆尔草中蒙药科技有限公司