一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，包括多孔板、保护盖和磁力架，磁力架内设有永磁体，磁力架的上缘设有用于固定多孔板的卡槽，多孔板的底部卡装在卡槽内，多孔板的顶部盖有保护盖；多孔板内设有以阵列方式分布的若干阵列孔，所有阵列孔的阵列孔底部位于同一水平面内，且阵列孔的底部面积小于其顶部面积。该一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板制备简单、成本低廉、使用方便，使磁珠法细胞分离和后续处理(培养、检测)在同一容器内完成，杜绝了人工进行细胞转移所造成的靶细胞丢失的缺陷，不仅可用于样本中靶细胞的磁珠法分离(分选)、培养、检测，也可用于其它生物靶分子的磁珠法分离和检测及普通的细胞培养、检测。
【专利说明】一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物【技术领域】，涉及一种用于靶细胞(分子)磁珠法分离、培养、检测的装置，具体涉及一种一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板。
【背景技术】
[0002]生物分子和细胞的分离、分选常被称为大海捞针，而在20世纪7-80年代，多种生物分子分离技术不断涌现出来，并很快从小分子分离发展到了实现完整细胞的分离、分选。
[0003]早已发现，磁性微粒(又称磁珠)经过处理可与抗体偶联，即可通过抗原-抗体反应与样本中抗原物质或细胞表面抗原结合，结合后形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物或细胞-抗体-磁珠免疫复合物，并在磁场作用下发生定向移动，从而使靶分子(或细胞)从复杂的环境中高效分离出来，达到从各种样本中富集、分离、分选特异性靶分子(细胞)的目的。
[0004]自从1982年,Langenaur和Schachner利用包被抗少突胶质细胞表面抗原的单克隆抗体的磁珠从混合的细胞群体(少突胶质细胞约占1.5% )中富集到纯度达91 %的目的细胞以来。磁珠分离技术以其富集特异性好、检测时间短等快速、高效的特点成为目前进行生物分子和完整细胞分离、分选的重要技术而被广泛应用。
[0005]同时，由于磁式分选技术中，吸附和解离靶标的条件仅仅需要外加磁场和撤离磁场这种极为简单的物理方法即可实现。同时，免疫磁珠也从抗体偶联磁珠发展到生物素磁珠、二抗磁珠、Oligo dT磁珠等各类纯化介质偶联磁珠。目前,免疫磁珠已被广泛应用高通量蛋白及抗体纯化、核酸分离、细胞分选等领域，成为生物靶分子和细胞高通量分析的理想选择。
[0006]尤其是其在细胞分选领域的应有更是突飞猛进。通常只需借助偶联在磁性微粒上的抗体高特异性识别并标记目标细胞表面抗原，再让混有磁珠的细胞悬液通过磁场，结合了磁珠的细胞即可被吸附在磁场侧壁上，而未结合的细胞被除去，得到纯化的目标细胞，从而实现高效的分选和富集。磁式细胞分选高效快速，可在2-30分钟内实现15到111个细胞的分选。
[0007]一般，磁式细胞分选可手动完成，简单快速，不需要特别昂贵的设备，对实验和技术要求较低，实验流程对细胞损伤小，无菌和细胞状态更有保证，且有极好的回收率和存活率，通常纯度可达99%，回收率>90%。同时，分选得到的细胞可进行培养、血液回输或者流式分析。目前，磁式细胞分选已经成为分离造血干细胞、祖细胞、抗原特异性T或B细胞、肿瘤细胞等靶细胞的重要工具，也可作为对流式分选前样本进行预处理。
[0008]目前，主要的磁式细胞分选产品品牌有德国美天旎(MACS)、Invitrogen旗下Dynal, BD公司、StemCell公司、R&D公司等等。其生产的磁珠虽大小各有不同，但多是由多聚糖和氧化铁组成的超顺磁化微粒。而用于磁珠分离的容器(分离管)多采使用试管式分离(tube-based)，一般可根据样本体积选用常规的不同容量的试管或离心管作为分选容器(如普通的印pendorf离心管或者5ml或15ml离心管等)。而用于磁性分离的磁力架，也叫分选器(separator)就是为磁珠标记细胞提供分离磁场的一块永磁铁，均为配合相应磁性分离管和离心管而设计的。在使用时磁力架通常是吸附在特制铁架的垂直面上，可根据分离柱和下面回收管高度随意调整位置。磁珠标记靶细胞(分子)被吸附在管壁或者管底，经过几次重复清洗即可完成分选。分选器可以手动或全自动方式完成单管、4联管、8联等不同的分离管完成不同数量样本分选。
[0009]按照现有磁珠分选仪器设计策略和操作程序，在磁性分离完成之后，仍需采用吸管或移液器将分选的靶分子(细胞)转移到相应的保存管、培养板或检测管等容器内进行后继处理或检测(如流式细胞仪分析或分选、分子生物学研究、细胞培养、回输给人或者动物，也可与荧光显微镜术、PCR或FISH等等)。而这一操作过程，无论是采用人工方式还是自动方式，均不可避免地会造成靶细胞(分子)不同程度的丢失，从而不同程度影响后续实验结果，尤其是对于筛选低丰度靶细胞(分子)而言，这一缺陷的影响通常会是毁灭性的。因此，为弥补磁珠分离设备和操作方法的缺点，提供新的分选器和相应容器，优化分选操作步骤，最大程度减少靶细胞(分子)的丢失成为提高磁珠分选可靠性的关键，对于样品中低丰度细胞的分离尤为重要。
实用新型内容
[0010]本实用的目的在于提供一种一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，以克服现有磁珠分离技术造成的靶细胞丢失的缺陷，提高磁珠分选的敏感性和可靠性。
[0011]为达到上述目的，本实用新型是通过以下技术方案来实现的:
[0012]一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，包括多孔板、保护盖和磁力架，磁力架内设有永磁体，磁力架的上缘设有用于固定多孔板的卡槽，多孔板的底部卡装在卡槽内，多孔板的顶部盖有保护盖；多孔板内设有以阵列方式分布的若干阵列孔，所有阵列孔的阵列孔底部位于同一水平面内，且阵列孔的底部面积小于其顶部面积。
[0013]所述的阵列孔上部的形状为圆柱体形或棱柱体形，下部的形状为相应的倒圆台体形或倒棱台体形。
[0014]所述的阵列孔的深度为1.0cm?3.0cm，顶部面积为0.95cm2?9.5cm2，底部面积为 0.32cm2 ?2cm2 ο
[0015]所述的阵列孔底部透明，厚度为0.15?1.5mm。
[0016]所述的多孔板和保护盖均采用透明材质通过一次成型技术制作而成。
[0017]所述的透明材质包括聚苯乙烯、聚丙烯和玻璃。
[0018]所述的磁力架采用橡胶或塑料制备而成，为平板式结构。
[0019]与现有技术相比，本实用新型具有以下有益的技术效果:
[0020]本实用新型提供的一体式靶细胞磁珠法分离、培养、检测板构造简单、便于制备、成本低廉、使用方便，非常适合于靶细胞(分子)的磁珠式分选，并且使细胞的磁珠分离和后继处理(培养、检测)在同一容器内完成，免除了采用吸管或移液器进行磁珠分选后靶细胞转移的操作步骤，最大程度降低了现有技术在细胞转移中造成的靶细胞丢失的缺陷，不仅可用于样本中靶细胞的磁珠法分离(分选)、培养、检测，也可用于其它生物靶分子的磁珠法分离和检测及普通的细胞培养、检测，能够提高磁珠分选的阳性率、敏感性和可靠性，显著节约实验时间、人力、物力和试剂，尤其是对于低丰度靶细胞(分子)的分选和后继处理更为重要。同时，该实用新型中由于采用阵列式结构的多孔板，因而可一次性同时对多种(个)样本进行靶细胞(分子)的分离、后继处理或直接检测，尤其可直接使用倒置显微镜、正置显微镜、激光共聚焦显微镜、数字化显微镜或扫描仪进行图像摄取和观察、分析。本实用新型可在医学诊断、药物开发、细胞生物学等领域推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板纵剖面结构示意图；
[0022]图2是一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板组合后纵剖面结构示意图；
[0023]其中，1-多孔板、2-磁力架、3-保护盖、4-阵列孔、5-阵列孔底部、6-永磁体、7-卡槽。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图对本实用新型做进一步的详细说明，所述是对本实用新型的解释而不是限定。
[0025]参见图1和图2，本实用新型提供的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，包括多孔板1、保护盖3和磁力架2。
[0026]多孔板I上设有以阵列方式分布的若干阵列孔4，阵列孔4的上部形状为圆柱体形或棱柱体形，下部形状为相应的倒圆台体形或倒棱台体形；阵列孔的底部面积小于其顶部面积，阵列孔深度为1.0cm?3.0cm，顶部面积为0.95cm2?9.5cm2,阵列孔底部5透明、面积为0.32cm2?2cm2、厚度为0.15?1.5mm,且所有阵列孔底部5位于同一水平面内。
[0027]保护盖3可完全覆盖于多孔板上，用于实验操作和检测过程中防止阵列孔内样本不被污染及保存。
[0028]多孔板I和保护盖3采用聚苯乙烯、聚丙烯或玻璃等材质，按照上述设计要求，采用吹塑或注塑等一次成型技术分别制备，制备简单，成本低廉，并在制作时可以根据需要放大和缩小。
[0029]磁力架2由橡胶或塑料制成平板式结构，表面平整，永磁体6位于由橡胶或塑料制成的磁力架2内，磁力架2上缘设置有用于放置和固定多孔板I的卡槽7，多孔板I的底部能够卡装在卡槽7内。磁力架2上的卡槽7大小与多孔板I相匹配，在制作时可以根据需要放大和缩小。
[0030]使用上述一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，使细胞的磁珠分离和后继处理(培养、检测)在同一容器内完成，因此，能十分方便、快速分选出目的细胞，并提高阳性细胞检出率。其具体使用方法如下例所示:
[0031](I)离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液(0.5% BSA,0.08% EDTA pH7.2PBS，)充分混悬细胞(0.5ml/lX108细胞)，加入相应的一抗(10?20μ8/πι1终浓度)，4°C孵育30分钟。离心后用适量PBE洗细胞一次，离心后再加PBE (0.3ml/l X 18细胞)充分混悬细胞后，转移入多孔板I的阵列孔4中，并加入相应二抗包被的磁珠，混匀后置室温孵育10?15分钟。
[0032](2)将多孔板I安装入相应磁力架2的卡槽7内，静止并磁力吸附5?10分钟，弃上清后将多孔板从相应磁力架2的卡槽7内取出，加入适量PBE重悬细胞后，再次将多孔板I安装入相应磁力架2的卡槽7内，静止并磁力吸附5?10分钟。
[0033](3)重复⑵操作2?3次后将多孔板I从相应磁力架2的卡槽7内取出，进行后续试验(直接培养或检测等)。在实验过程中加盖保护盖3以防止污染。
[0034]本实用新型所提供的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，制备简单、成本低廉、使用方便，使细胞的分离和后续处理(培养、检测)在同一容器内完成，尤其适用于采用磁珠法进行靶细胞的分离和检测，无需采用吸管或移液器进行靶细胞的转移即可完成靶细胞的磁珠分选和后继处理(培养、检测或分析)，杜绝了人工进行细胞转移所造成的靶细胞丢失的缺陷，提高目的细胞的阳性检出率、敏感性和可靠性。此外，本实用新型所提供的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板除用于样本中靶细胞的磁珠法分离(分选)、培养、检测夕卜，也可用于其它生物靶分子的磁珠法分离、检测，以及普通的细胞培养、检测。
【权利要求】
1.一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，其特征在于，包括多孔板(I)、保护盖(3)和磁力架(2)，磁力架(2)内设有永磁体(6)，磁力架(2)的上缘设有用于固定多孔板(I)的卡槽(7)，多孔板⑴的底部卡装在卡槽(7)内，多孔板⑴的顶部盖有保护盖(3);多孔板(I)内设有以阵列方式分布的若干阵列孔(4)，所有阵列孔(4)的阵列孔底部(5)位于同一水平面内，且阵列孔(4)的底部面积小于其顶部面积。
2.根据权利要求1所述的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，其特征在于:所述的阵列孔(4)上部的形状为圆柱体形或棱柱体形，下部的形状为相应的倒圆台体形状或倒棱台体形。
3.根据权利要求1或2所述的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，其特征在于:所述的阵列孔(4)的深度为1.0cm?3.0cm，顶部面积为0.95cm2?9.5cm2，底部面积为0.32cm2 ?2cm2。
4.根据权利要求1或2所述的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，其特征在于:所述的阵列孔底部(5)透明，厚度为0.15?1.5mm。
5.根据权利要求1或2所述的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，其特征在于:所述的多孔板(I)和保护盖(3)均采用透明材质通过一次成型技术制作而成。
6.根据权利要求5所述的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，其特征在于:所述的透明材质包括聚本乙纟布、聚丙纟布和玻璃。
7.根据权利要求1或2所述的一体式磁珠法细胞分离、培养、检测板，其特征在于:所述的磁力架(2)采用橡胶或塑料制备而成，为平板式结构。
【文档编号】C12M1/00GK203923172SQ201420333907
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】张明娟, 张澍, 张超英, 杨军, 李宗芳 申请人:西安交通大学