一种基于免疫磁珠-多重pcr的沙门氏菌快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠-多重PCR的沙门氏菌快速检测方法。
【背景技术】
[0002]沙门氏麗{Salmonella、是肠杆菌科中一种重要的人畜共患、革兰氏阴性病原菌。动物源性沙门氏菌易引起摄食者急性腹泻，甚至暴发食物中毒，导致胃肠炎、伤寒及副伤寒，给人类健康造成了威胁。
[0003]鸡白痢沙门氏菌可引起鸡白痢。主要流行于2-3周龄的雏鸡，但目前出现了易感日龄增大和临床病型多样化的趋势，导致整个养鸡周期都受本病的危害。鸡白痢病雏常表现瞌睡、虚弱和食欲丧失，聚成一团，两翅下垂，排便时会发出尖锐的叫声，在肛门及周围常附有粉白色或绿色的排泄物，可造成雏鸡20-30%的死亡率。在育成鸡中可引起10-20%的死亡率，病鸡多为病雏未彻底治愈厚转为慢性，或育雏期间感染所致。成鸡不表现急性感染的特征，常表现为无症状感染。
[0004]肠炎沙门氏菌与鸡白痢沙门氏菌引起的鸡群发病症状非常相似，但肠炎沙门氏菌的宿主比鸡白痢沙门氏菌更为广泛，是目前引起人类食物中毒的主要病原菌之一，其感染主要是因为食用被肠炎沙门氏菌污染的动物性食品，尤其是家禽的肉和蛋，因而关于该菌的研究倍受国内外学者的关注。
[0005]由于沙门氏菌血清型繁多，各类生化反应复杂，目前已经建立了多种沙门氏菌检测方法，如传统培养法、酶联免疫法、生物传感器技术、核酸扩增技术，但这些方法或程序繁琐、耗时费力，或特异性低，或敏感性差，或成本昂贵等，不适用于快速检测及普及应用，因此，建立一种能够快速准确同时检测沙门氏菌属、鸡白痢沙门氏菌及肠炎沙门氏菌的方法至关重要。
[0006]多重PCR反应(Multiplex PCR)于1988年由Chamberlain等首次提出，又称多重引物PCR或复合PCR，由于能够在同一体系同时扩增多个目的基因，多重PCR技术已具有单项PCR技术无可比拟的优越性:节省时间，降低成本，减轻了工作量，特别是能够节省珍贵的实验样品等优点。但是，由于实际应用中，待检样品往往成分复杂，对PCR检测结果存在较大的干扰性，影响检测结果的灵敏度和准确度。本发明中，采用免疫磁珠对样品进行沙门氏菌富集，可去除样品中除目标菌以外的其他成分，避免或减少了对后续PCR扩增的干扰，从而提高了检测灵敏度和准确性，且可对沙门氏菌属、肠炎沙门氏菌以及鸡白痢沙门氏菌同时进行鉴定，既经济又简便。
【发明内容】
[0007]本发明旨在针对现有技术不足，提供一种基于免疫磁珠-多重PCR的沙门氏菌快速检测方法。采用本发明的检测方法检测沙门氏菌，检测时间短，灵敏度高，特异性强，成本低。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现的。
[0009]本发明设计一种基于免疫磁珠-多重PCR的沙门氏菌快速检测方法，包括如下步骤:
(O分别合成特异性扩增沙门氏菌属、肠炎沙门氏菌以及鸡白痢沙门氏菌的引物对；
(2)采用沙门氏菌特异性免疫磁珠对待测样品中沙门氏菌进行富集，提取细菌DNA；
(3)利用步骤(I)中合成的引物对采用多重PCR方法进行扩增；
(4)凝胶电泳检测扩增产物，判断样品中是否含有肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌或其他沙门氏菌；
(5)结果判断:取PCR扩增产物5μ L，用I %的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察，如果电泳结果在796bp位置出现单一扩增条带，则说明样品中含沙门氏菌，但不是肠炎沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌；如果电泳结果在796bp和600bp位置同时出现扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；如果电泳结果在796bp和304bp位置同时出现扩增条带，则说明样品中含有肠炎沙门氏菌；如果电泳结果在796bp、600bp及304bp位置均未出现扩增条带，则说明样品中不含沙门氏菌。
[0010]步骤(I)中免疫磁珠富集沙门氏菌的方法已包含在专利:一种基于免疫磁珠富集沙门氏菌的方法(专利号:201410772937.0)。
[0011]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
(I)缩短检测时间:利用免疫磁珠富集沙门氏菌，能够有效代替沙门氏菌检测过程中的增菌操作步骤，缩短检测时间。
[0012](2)提高检测灵敏度和准确度:沙门氏菌特异性免疫磁珠对样品中微量沙门氏菌进行富集的同时，还能去除样品中除目标菌以外的其他成分，以防止对后续多重PCR的干扰，有效避免或减少假阳性，提高检测灵敏度和准确度。
[0013](3)操作简便、成本低:本发明设计的检测方法不需要大型仪器和特殊培训的专业人员，不需要昂贵的试剂，检测成本低。
【附图说明】
[0014]图1为实施例2中一种基于免疫磁珠-多重PCR的沙门氏菌快速检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果图。
[0015]图2为实施例3中一种基于免疫磁珠-多重PCR的沙门氏菌快速检测方法灵敏性评价实验凝胶电泳结果图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Habor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0017]实施例1 一种基于免疫磁珠-多重PCR的沙门氏菌快速检测方法的建立 (I)合成特异性扩增沙门氏菌属、肠炎沙门氏菌以及鸡白痢沙门氏菌的引物对；
根据文献报道，分别合成m、mem Si//?三个引物对，引物序列及相关信息具体如下:
沙门氏菌特异引物序列:
i/jvA-F: 5’ -CGGTGGTTTTAAGCGTACTCTT-3’ ；
?ηνΑ-R: 5’ -CGAATATGCTCCACAAGGTTA-3’ ；
肠炎沙门氏菌特异性引物序列:
sdfl -F:5’ -TGTGTTTTATCTGATGCAAGAGG-3’ ；
sdfl -R:5’ -TGAACTACGTTCGTTCTTCTGG-3’ ；
鸡白痢沙门氏菌特异性引物序列: fliC -F:5，-GCGGAAAATAACACTGCGG-3，； fliC -R:5，-TGCCCCCAGAGAAGAACGAA-3，；
其中，StZfi引物序列记载于如下文献中:PG Agron, RL Walker.1dentificat1n bysubtractive hybridizat1n of sequences specific for Salmonella enterica serovarEnteritidis[J], Am Soc Microb1l,2001, ,67 (11):4984-4991 ；
HiC引物序列记载于如下文献中:薛俊龙，张伟业.鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的建立与应用[J].畜牧兽医杂志，2011，30 (6):23-27 ；
引物序列记载于如下文献中:PM Fratamico, TP Strobaugh.Simultaneousdetect1n of Salmonella spp and Escherichia coli 0157:H7 by multiplex PCR[J].Journal of Industrial Microb1logy and B1technology,1998, 21 (3): 92-98。
[0018](2)免疫磁珠富集沙门氏菌
分别取200 μ L含有鸡白痢沙门氏菌(ATCC 13036)和肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)的12h液体培养物加入到300 μ L沙门氏菌特异性免疫磁珠中，进行沙门氏菌富集。
[0019]免疫磁珠富集沙门氏菌的方法已记载于如下专利中:一种基于免疫磁珠富集沙门氏菌的方法(专利号:201410772937.0)
(3)DNA模板制备
将吸附沙门氏菌的免疫磁珠放入1.5ml离心管中，加入10yL无菌双蒸水重悬，12，000r/min离心5min，弃上清液。用100 μ L无菌双蒸水重新悬浮菌体，在沸水浴中煮lOmin，立即取出，在-80°C放置30min，然后在沸水浴中解冻，12，000r/min离心5min，取上清液放置_20°C备用。
[0020](4)多重PCR检测方法的建立
多重PCR的25 μ L反应体系具体为，10 X PCR反应缓冲液2.5 μ L，25mmol/L的Mg2+2.0μ L，2.5mmol/L 的 dNTP 4.5 μ L, 10 μ M invA 引物对 1.2 μ L，10 μ M fliC 引物对 0.4 μ L，1yMsdfI引物对0.8μ L , 2.5U/ μ L Taq酶0.5U，模板溶液2 μ L，最后用无菌双蒸水补至25 μ L ;PCR检测体系扩增参数具体为:94°C预变性5min ;之后开始扩增循环，每个循