一种dna四面体纳米结构信号探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA四面体纳米结构信号探针及其应 用。
【背景技术】
[0002] DNA电化学生物传感器以其快速、灵敏、低成本及易微型化等优点在临床医药、食 品检验、环境检测以及反恐等各个领域有着巨大的潜在用途。决定DNA电化学生物传感器 性能的一个重要方面就是信号放大体系。
[0003] 由于DNA作为生物标志物在疾病诊断中具有非常重要的地位。因此用于检测临床 样本中低浓度的DNA的生物标志物的超灵敏DNA传感器至关重要。其中，电化学DNA传感 器是有前途的一个，因为其响应速度快，使用方便，成本低，可以直接进行DNA检测。电化学 DNA传感器于2003年被首次发明，其中"三明治"式的电化学DNA传感器得到了广泛的应 用。一个典型的"三明治"式的电化学DNA传感器由固定到电极上的单链DNA捕获探针识 别层的和一个单链DNA信号探针将目标DNA固定在电极表面，并通过各种方式转化为电化 学信号。捕获探针和信号探头与目标DNA形成夹心结构，看起来像一个"三明治"。
[0004] 要想使得"三明治"式的电化学DNA传感器提高灵敏度，两个关键部分是"识别层" 与"信号转导"。"识别层"最常用于电化学DNA传感器的捕获探针是巯基修饰的单链DNA， 通过金-硫键实现捕获探针在电极上的固定。但这种方法存在一定的缺陷，因为单链DNA 是一种柔性的分子，并且探针DNA的碱基与金之间有吸附位点，单链DNA容易平躺在金表面 上。科学家们尝试了多种方法来改善这种情况。例如，添加一些小分子稀释剂，这样小分子 可以取代探针碱基与金之间的相互作用，使探针DNA-定程度直立在电极表面。最近，DNA 四面体纳米结构捕获探针吸引了极大的兴趣。三维的DNA四面体纳米结构最早在2004年 开发，然后首次在2010年用于电化学DNA传感器。根据报道，DNA四面体可以固定在金电极 表面，通过修改其三个顶点与硫醇基团，而第四顶点可以被设计成具有为互补的靶DNA或 miRNA的一部分的延伸的DNA捕获探针。由于其刚性结构的优点，该DNA四面体纳米结构 可保证该DNA捕获探针具有良好控制的密度和取向。"信号转导"是提高电化学检测性能又 一个非常重要的因素。大量的信号分子如氧化还原酶，纳米颗粒标记已经被用来放大信号。 辣根过氧化物酶（HRP)具有稳定，高效，可商购的，容易与DNA探针上的生物素共价结合等 优点。因此被广泛应用于电化学生物传感器的信号转导。
[0005]通常，用于结合HRP的信号探针是生物素修饰的单链DNA。然而，由于一条单链DNA信号探针通常只能结合一个HRP酶，从而导致酶反应的效率不高。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种DNA四面体纳米结构 信号探针，所述信号探针为由一条5'端延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA和三条5'端 修饰了标记分子的单链DNA自组装形成的一个具有四面体底座的DNA信号探针，所述四面 体的一个顶点上延伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列与待测目标DNA或miRNA互 补结合，其他三个顶点含有标记分子。
[0007] 优选的，所述标记分子为生物素分子。所述标记分子能特异性地与带修饰的信号 分子结合，实现多信号放大。所述带修饰的信号分子为带修饰的氧化还原酶；更优选的，所 述带修饰的氧化还原酶为亲和素修饰的氧化还原酶，通过生物素和亲和素的结合作用连接 和氧化还原酶分子，进而通过DNA碱基互补产生信号。
[0008] 优选的，所述氧化还原酶选自辣根过氧化酶或葡萄糖氧化酶；更优选辣根过氧化 酶。
[0009] 优选的，所述四面体的边长可以通过调整DNA碱基配对数来改变其长度。更优选 的，所述四面体的边长是由17对碱基互补配对形成。
[0010] 优选的，构成所述DNA四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列，如SEQID NO. 1~4所示：
[0011] Tetra-a-reporter：
[0012] 5'-AAAAAAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAG TA-3'。（SEQ ID NO. 1)
[0013] 优选的，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA识别序列。
[0014] Tetra-b：
[0015] 5'-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'。（SEQ ID NO. 2)
[0016] Tetra-c：
[0017] 5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'。（SEQ ID NO. 3)
[0018] Tetra-d：
[0019] 5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'。（SEQ ID NO. 4)
[0020] 优选的，自组装形成DNA四面体纳米结构信号探针的形成条件为95°C3min，而后 立即降温到4摄氏度。
[0021] 本发明第二方面公开了一种电化学检测方法，具体包括如下步骤：
[0022] (1)先将待测目标DNA或miRNA和四面体DNA纳米结构信号探针混合预杂交得混 合液，再将组装好的含四面体捕获探针的工作电极插入到所述混合液中再杂交；
[0023] (2)加入氧化还原酶和相应的底物，进行电化学检测。
[0024] 优选的，步骤（1)中，所述DNA四面体纳米结构信号探针，所述信号探针为由一条 5'端延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA和三条5'端修饰了标记分子的单链DNA自组 装形成的一个具有四面体底座的DNA信号探针，所述四面体的一个顶点上延伸所述DNA识 别序列，所述的DNA识别序列与待测目标DNA或miRNA互补结合，其他三个顶点含有标记分 子。
[0025] 优选的，所述标记分子为生物素分子。
[0026] 优选的，所述四面体的边长可以通过调整DNA碱基配对数来改变其长度。更优选 的，所述四面体的边长是由17对碱基互补配对形成。
[0027] 优选的，构成所述DNA四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列，如SEQID NO. 1~4所示：
[0028] 5'-AAAAAAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAG TA-3'。（SEQ ID NO. 1)
[0029] 优选的，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA识别序列。
[0030] Tetra-b：
[0031] 5' -TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCMTAC -3'〇(SEQ ID NO. 2)〇
[0032] Tetra-c：
[0033] 5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'。（SEQ ID NO. 3)〇
[0034] Tetra-d：
[0035] 5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3' （SEQ ID NO.4)〇
[0036] 优选的，自组装形成DNA四面体纳米结构信号探针的形成条件为95°C3min，而后 立即降温到4摄氏度。
[0037] 优选的，步骤（2)中，DNA四面体捕获探针，为将三条5'修饰了巯基的单链DNA和 一条在3'延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA自组装形成具有四面体底座的DNA探针， 所述四面体的其中三个顶点含有巯基基团，用于固定在电极表面，在剩下的一个顶点上延 伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列与目标DNA或miRNA的序列互补，通过所述信号 探针末端的标记分子与带修饰的信号分子结合产生电化学信号进行电化学检测。
[0038] 优选的，步骤（2)中，所述捕获探针可以保证顶端的DNA识别序列不易和电极表面 相互作用，而且作为底座的四面体纳米结构，由于自身的特殊结构特点，可