一种基于镧系金属的双功能纳米探针及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于镧系金属的双功能纳米探针及其制备方法与应用，属于分析 化学领域。
【背景技术】
[0002] 动态可视化和高灵敏定量分析生命体系中重要的调控分子对生物学和临床研究 具有重要的意义。荧光检测方法由于具有高的灵敏性和时空分辨率，使得荧光成像方法在 生物分子和生物过程的实时可视化检测中得到了广泛的发展。然而，利用荧光方法实现生 物分子的定量检测还面临着巨大的挑战。这是由于：首先，利用荧光共振能量转移方法可以 设计比率型荧光探针实现蛋白酶的定量检测，但是该方法需要供体荧光的发射光谱与受体 荧光的激发光谱有重叠，有限的供体-受体荧光分子对大大限制了该方法的应用；其次，大 多数荧光分子对生理环境的变化比较敏感，如PH、粘度、离子强度等等，这就导致实现生物 分子的原位准确定量检测存在困难；再次，生物样本的自发荧光，也会对生物分子的荧光定 量检测产生干扰。荧光方法为生物分子的实时监测提供了一个灵敏的分析方法，但是以上 的因素限制了将荧光方法发展为荧光分子的准确定量方法。因此有必要进一步研究，发展 荧光分子的灵敏定性和准确定量的新方法。
[0003] 利用质谱方法开展蛋白酶的定量研究，可以避免荧光检测中的环境因素的影响和 背景荧光的干扰。此外，相比于光学检测方法而言，利用质谱方法可以检测整个生物样本里 生物分子的活性，而不仅仅限于细胞或者组织表面生物分子的活性，因此，质谱可以为蛋白 酶的检测提供相对准确的定量方法。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)，由于低的灵敏度和 宽的线性范围，通过结合元素标记技术，已被成功地用于细胞、蛋白酶以及DNA的定量检测 研究中。但是，生物分子的检测效果只有通过最终的质谱表征才能获悉，无法实现生物分子 的实时、原位、可视化的分析。
[0004] 传统的探针只具备单一的信号响应性能，因此不能同时实现生物分子现场的动态 可视化和高灵敏定量分析。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于镧系金属的双功能纳米探针及其制备方法与应用， 本发明能实现生物分子现场的动态可视化和高灵敏度定量分析。
[0006] 本发明提供的基于镧系金属的双功能纳米探针，该纳米探针由多肽N端的册12与 BCTOT上的SO2Cl生成SO2-NH连接，所述多肽C端上含有SH与纳米材料连接，且所述多肽 上连接的BCTOT与镧系金属离子螯合组成；
[0007] 所述多肽上含有蛋白酶的剪切位点。
[0008] 本发明中，所述多肽起到连接BCTOT与纳米材料的作用，并且还起到带有蛋白酶 的剪切位点的作用。
[0009] 上述的纳米探针中，所述多肽的长度为7~10个氨基酸残基；
[0010] 所述纳米材料为纳米金、纳米银、纳米娃、石墨稀、碳纳米管或上转换纳米颗粒；
[0011] 所述镧系金属离子为铕离子、铽离子、铒离子或镱离子；铕的元素符号为EU，具体 可为EuClJ^水溶液中电离出来的Eu'。
[0012] 上述的纳米探针中，所述多肽中蛋白酶的剪切位点的氨基酸序列为DEVD;
[0013] 所述纳米材料为颗粒状，所述纳米材料的粒径为IOnm~100nm。
[0014] 上述的纳米探针中，所述多肽的氨基酸序列是N端-GKDEVDAPGC-C端。
[0015] 本发明还提供了上述基于镧系金属的双功能纳米探针的制备方法，包括如下步 骤：1)将所述多肽作为桥联剂首先与天线分子BCTOT反应，得到BCTOT修饰的多肽；
[0016] 2)将所述BCTOT修饰的多肽与所述镧系金属离子螯合反应，得到螯合后的多肽溶 液；
[0017] 3)将所述螯合后的多肽溶液与所述纳米材料溶液反应，即得到基于镧系金属的双 功能纳米探针。
[0018] 本发明中，所述 BCTOT 的英文命名为 1，10-bis (5'_chlorosulf〇-thiophene-2'-y 1)-4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7-octafluorodecane-l，3, 8, 10-tetraone ;所述 DEVD 是 Caspase-3 底 物。
[0019] 上述的方法中，所述多肽与所述BCTOT的摩尔比可为1 :0. 5~1，具体可为1:1 ;
[0020] 步骤1)中，所述反应的温度可为10~30°C，反应的温度是室温，一般室温指的是 10 ~3(TC ;
[0021] 所述反应的时间可为1~24h，具体可为12h ;
[0022] 步骤2)中，所述镧系金属离子与所述BCTOT的摩尔比可为0. 1~10:1，具体可为 1:1 ;
[0023] 所述镧系金属离子与所述BCTOT螯合后的浓度可为0. 1~100 μΜ，具体可为 10 μΜ ；
[0024] 所述螯合反应的温度可为30°C~60°C，具体可为50°C，所述螯合反应的时间可为 1~8h，具体可为4h ;所述螯合反应在摇床上进行反应。
[0025] 上述的方法中，所述纳米材料的粒径可为IOnm~IOOnm ;
[0026] 所述多肽与所述纳米材料的摩尔比可为100~3000 :1，具体可为3000 :1 ;
[0027] 步骤3)中，所述反应的温度可为10~30°C，反应的温度是室温，一般室温指的是 10 ~3(TC ;
[0028] 所述反应的时间可为1~36h，具体可为24h。
[0029] 上述的方法中，步骤1)中，所述反应的体系中还加入缚酸剂，所述反应的体系在 摇床上进行反应，所述BCTOT修饰到所述多肽的N端上；
[0030] 所述缚酸剂为三乙胺和/或吡啶；
[0031] 所述多肽与所述缚酸剂的摩尔比可为1 :0. 05~1:0. 2。
[0032] 本发明所述的双功能纳米探针在如下（1)或（2)或（3)所示的应用：
[0033] (1)所述的双功能纳米探针在对蛋白酶的定性和/或定量检测中的应用；或所述 的双功能纳米探针在制备定性和/或定量检测蛋白酶的产品（如试剂盒）中的应用；
[0034] (2)所述的双功能纳米探针在对蛋白酶的细胞内成像中的应用；或所述的双功能 纳米探针在制备对蛋白酶的细胞内成像的产品中（如试剂盒）的应用；
[0035] (3)所述的双功能纳米探针在筛选蛋白酶的增强剂或抑制剂中的应用；或所述的 双功能纳米探针在制备筛选蛋白酶的增强剂或抑制剂的模型中的应用。
[0036] 本发明应用时，所述定性检测采用光谱检测，所述定量检测采用质谱检测；
[0037] 所述光谱检测具体为细胞成像，所述质谱检测具体为ICP-MS定量检测；
[0038] 和/或，所述定性和/或定量检测为体外和/或活细胞内进行。
[0039] 本发明应用时，所述蛋白酶为caspase-3 ;
[0040] 或，所述体外定性检测的方法包括如下步骤：
[0041] 当采用光谱检测和/或质谱检测时，按照如下步骤进行：1)将所述基于镧系金属 的双功能纳米探针溶液加入到体外的检测样品中，反应，然后将所述反应的体系离心，取上 清液，光谱检测和/或质谱检测上清液，若有检测到荧光和/或所述镧系金属离子信号响 应，则表明待测样品中含有蛋白酶；
[0042] 或，所述细胞内定性检测的方法包括如下步骤：将所述基于镧系金属的双功能纳 米探针溶液加入活细胞中，反应，然后将孵育了所述探针的所述活细胞进行裂解后，离心分 离收集上清液，质谱检测检测上清液，若有