基于纳米探针的遗传学检验的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域并涉及检测靶核酸分子中的突变的方法。另外，本发明 涉及包含如本文所述的第一缀合物和第二缀合物的试剂盒以及此类试剂盒用于检测靶核 酸分子中的突变或用于将基因型指定给靶核酸的用途。
【背景技术】
[0002] 全基因组关联研究日益将人遗传变体与个体对治疗剂的应答相联系。该增长的知 识大大加速了个性化医学的进展。通过鉴定与药物功效和安全性相关联的遗传热点，药物 基因组学(PGx)策略允许基于患者遗传组成的更加个体化的药物疗法。继而，个体化药物疗 法可使副作用最小化并且改善结果(Daly,AK(2010)Nat Rev GenetJl ,241-246)。现如今， PGx信息已被纳入许多药物标签中以辅助临床医生做出治疗决策。
[0003] -个实例是PGx指导的华法林给药。华法林是得到最广泛描述的口服抗凝药。尽管 华法林有效，但其由于窄的治疗指数和高度可变的个体间给药要求而位列具有严重不良事 件报告的前10种药物中。因此，重要的是用国际标准化比率(INR)来频繁监测抗凝状态，尤 其是在开始华法林疗法后的早期。缺乏可用于鉴定适当初始剂量的信息通常导致多次剂量 调整并增加血栓栓塞事件或出血的风险。在过去十年里，PGx研究揭示了华法林剂量要求与 若干遗传学单核苷酸多态性（SNP)的存在之间的相关性。最显著相关的SNP包括细胞色素 P450酶CYP2C9基因中的两种编码变异：CYP2C9*2(rsl799853)和CYP2C9*3(rsl057910);和 维生素 K环氧化物还原酶复合物I(VKORCl)基因中的一种变异：启动子SNP-1639G>A (rs9923231)(The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium(2009)N Engl J Med,360,753-764)。这些SNP可解释高达35%的患者间华法林剂量可变性。在2010 年，美国FDA更新了带有PGx指导剂量范围的华法林的标签规定（Highl ights of prescribing information·Coumadin(2010)http://packageinserts·bms·com/pi/pi_ coumadin. pdf)。可通过参考包含稳定维持剂量的表格来预测起始剂量，所述稳定维持剂量 是在具有CYP2C9和VK0RC1变体的不同组合的多位患者中观察得到。结合了传统临床因素和 患者遗传状态的给药算法也是可用的。近来，大规模的前瞻性研究发现PGx指导的华法林疗 法将刚开始华法林疗法的患者的住院率降低了~30% (Epstein，RS等人，（2010) J Am Col 1 Cardiol，22，2804-2812)。随机临床试验CoumaGen-II为将基因型知识整合到剂量选择中的 临床益处提供了进一步的证据(Anderson,JL等人，（2012)Circulation, 125，1997-2005) 〇 随着华法林基因分型的价值被越来越多的临床试验所支持，可预期PGx结果对临床实践的 重要性也会日益增加。快速且高性价比的基因型检验将大大促进此过程。
[0004] 当前可用的基因分型平台包括DNA微阵列、实时聚合酶链反应(PCR)、单碱基延伸 和高分辨率解链分析(Kim,S和Misra，A(2007)Annu Rev Biomed Eng，9,289-320)。尽管这 些平台在高通量研究中非常有用，但其由于涉及到昂贵的仪器和试剂而在按需临床检验中 的性价比较低（Joyce,HS(2011)Expert Opin Pharmacol，12,435-441) ADA已批准了四种 针对华法林敏感性基因分型的商业测定，包括无限（Inf ini ty)华法林测定(Autogenomics， Inc. ,Vista,CA,USA)、E感应（eSensor)华法林敏感性试验（GenMark Diagnostics，Inc.， Carlsbad ,CA, USA)、eQ-PCR LC 华法林基因分型试剂盒(TrimGen ,Sparks ,MD ,USA)和威力基 因（Verigene)华法林代谢核酸试验(Nanosphere ,NorthBrook, IL,USA)。这些测定中的一些 以护理点(point-of-care)应用为目标，但需要专门的仪器来进行检验。
[0005] 高度异质样本(例如肿瘤样品）的基因型分析比SNP基因分型更具挑战性，因为体 细胞突变检测必须在大的野生型DNA背景下进行。对于杂合SNP样品，MUT/WT等位基因比率 为50%，而对于肿瘤样本中的体细胞突变而言，该比率可小于10%。需要高度敏感的检测方 法来测量突变。通常，采用通过等位基因特异性PCR富集突变序列或PCR钳制策略来实现高 敏感性(Mi lbury，CA( 2009) Cl in Chem ,55,632-640) 〇
[0006] 近来，制备出一种新型等离子体纳米粒子(NP)探针：用非离子吗啉代寡核苷酸 (MOR)功能化的金NP(Zu，Y等人，（2011 )Small，7,306-310)』ΝΑ靶的检测基于杂交时纳米探 针稳定性的变化，即，纳米探针在结合至带负电的DNA靶时变得更加稳定。可简单地通过向 溶液中添加盐来揭示NP稳定性变化。靶稳定化的纳米探针的颜色保持为红色，而未附接DNA 的纳米探针将聚集，从而导致溶液颜色改变。可通过靶-探针杂交体的多种解链转变温度 (Tm)(图1)对具有类似序列的靶加以区分。极其尖锐的转变确保了高检测特异性。
[0007] 然而，由于基于纳米探针的方法的低敏感性(检测限~InM)，不能直接对基因进行 分析。在检测之前，需要通过PCR来扩增靶序列。在本研究中，已发现，T m值高度依赖于靶浓 度并且可受到测定溶液中存在盐的显著影响。由于PCR产率通常是未知的并且不同的主溶 液可含有多种盐组分，因此难以通过使用单组纳米探针和不同的扩增模板DNA分子来分析 PCR产物。此类检测方法描述于WO 2011/087456中。
[0008] 因此，尽管近年来付出了较大的研究努力，但仍未开发出允许结合护理点应用来 测定基因型的稳健遗传学检验平台。尽管如此，本领域中需要此类遗传学检验平台来加速 个性化医学的进展。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是通过提供一种组合物来满足上述需求，所述组合物包含如本文所 述的第一缀合物和第二缀合物或由其组成。意外的是，发明人已发现，使用至少两种不同的 缀合物(这些缀合物中的每一者均包含寡核苷酸类似物和纳米粒子)允许对SNP(单核苷酸 多态性)突变进行检测，而无需使用第二扩增模板DNA分子，即所谓的对照或参比分子。在本 文中，提供一种基于双纳米探针测定的稳健的遗传学检验平台，由此采用一对纳米探针以 允许对基因型的明确测定。所述平台利用不对称PCR(aPCR)进行靶序列扩增，并利用比色信 号进行端点检测。检测所需的唯一设备是标准热循环仪。测定信号可通过肉眼观察或通过 数码相机记录。因此，所述平台显著降低仪器和试剂的资本投资，并提供高性价比的检验。
[0010] 在一个方面，本发明因此涉及一种检测样品中的靶核酸分子中的突变的方法，其 包括以下步骤：（i)使包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物的第一缀合物与包含靶核 酸序列的等分试样在允许所述第一缀合物和所述靶核酸分子彼此杂交的条件下接触，以形 成第一缀合物:靶核酸分子复合物，其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子 共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸类似物包含 与所述靶核酸的未突变序列互补的碱基序列；（ii)使包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类 似物的第二缀合物与包含靶核酸序列的另一等分试样在允许所述第二缀合物和所述靶核 酸分子彼此杂交的条件下接触，以形成第二缀合物:靶核酸分子复合物，其中所述第二寡核 苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物， 其中所述第二寡核苷酸类似物包含碱基序列，所述碱基序列与所述靶核酸的突变序列互补 并且与所述第一寡核苷酸类似物的所述碱基序列相差至少一个核碱基，并且其中所述第一 寡核苷酸类似物和所述第二寡核苷酸类似物具有至少85%的序列同一性;和（iii)测定步 骤(i)和（ii)的所述复合物的解链温度T m并通过比较所述复合物的Tm来检测所述靶核酸分 子是否包含所述突变。
[0011] 在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含第一缀合物和第二缀合物，或由第 一缀合物和第二缀合物组成，所述第一缀合物包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物， 其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物 (PMO)或其衍生物，并且所述第二缀合物包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类似物，其中所 述第二寡核苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或 其衍生物，其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物相差至少一个核碱 基，并且其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物具有至少85%的序列同 一性。
[0012] 在另一个方面，本发明涉及如本文所述的试剂盒用于检测靶核酸分子中的突变或 用于将基因型指定给靶核酸的用途。
【附图说明】
[0013] 当与非限制实施例和附图结合考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明。
[0014]图1示出通过纳米探针识别DNA靶的示意图。当靶序列与探针完全匹配时，纳米粒 子在盐的存在下得以稳定。随着温度上升，靶/纳米探针杂交体在被称为1的温度下解离， 导致纳米粒子聚集以及溶液色变。单碱基错配导致T m下降5_15°C。当靶序列为随机的情况 下，纳米探针溶液在与盐一起温育1分钟后在室温下转成无色。
[0015]图2示出作为靶序列的函数的Tm。纳米探针和靶序列的单碱基错配导致1"降低5-15 °C。当采用两组纳米探针WT和MUT探针时，每个靶可获得一对Tmt3WT和MUT靶分别通过(TmWT_ WT、Im MUT_WT)和(Tm WT_MUT、Im mut_MUT)来表征。
[0016]图3示出通过使用WT和MUT纳米探针获得的1"的代表性散点图。根椐靶序列，数据 点（TmWT、TmMUT)位于其特定的线性区域(WT、MUT和杂合区域），这些线性区域几乎彼此平 行。红色虚线表示与异质样品中的MUT/WT比率变化对应的数据点的迹线。
[0017] 图4示出（a)p53WT纳米探针和(b)p53MUT纳米探针的作为合成靶浓度的函数的Tm 值。Tm测量误差=± 1°C。
[0018] 图5示出通过使用P53WT和MUT纳米探针和合成DNA靶获得的Tm WT和Tm MUT的散点 图。
[0019] 图6示出当合成DNA的MUT/WT序列比率变化时通过使用P53WT和MUT探针获得的Tm 值。Tm测量误差=± 1°C。
[0020]图7示出针对p53基因分析的基于纳米探针的遗传学检验的工作流程。
[0021 ] 图8示出p53基因的319-bp DNA片段的PCR扩增结果。
[0022]图9示出p53基因的基因分型密码子280G>A的散点图。gDNA样品提取自细胞系MCF-7和MDA-MB-230。杂合样品为WT和MUT gDNA的1:1混合物。每个样品的数据获自六次独立测 定(一些数据点彼此重叠）。
[0023] 图10示出当gDNA的MUT/WT序列比率变化时通过使用p53WT和MUT探针获得的Tm值。
[0024] 图 11示出靶向（a)CYP2C9*2SNP、（b)CYP2C9*3SNP和（c)VK0RCl-1639G>A SNP的WT 和MUT探针的作为合成