一种金纳米粒子探针比色法检测甲型流感病毒h3n2的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种金纳米粒子探针比色法检测甲型流感病毒H3N2的方法，具体是指单克隆抗体功能化修饰到金纳米粒子表面后，特异性识别甲型流感病毒H3N2并组装到其囊膜表面，从而引起金纳米粒子的表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)峰发生红移，继而观测到溶液颜色变化。
【背景技术】
[0002]流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行性感冒的RNA病毒。在世界各地，流感病毒感染是影响发病率和死亡率的一个重要因素。当禽流感和人类流感病毒同时感染中间宿主时，由于基因重组，极易产生新型流感病毒，危害社会。
[0003]传统的流感病毒检测的主要方法有病毒培养分离、免疫学诊断、分子生物学诊断。病毒分离方法经过了很长时间的考验，检测结果更为可靠，灵敏，可以检测出极少量病毒，但存在操作程序繁杂、费用高、实验室安全级别要求高(必须在BSL-3级实验室进行)，检测时间约需I?3周，耗时较长，在疫区大面积应用推广，大量样品检测方面存在较多限制条件。免疫学检测技术主要是基于抗原-抗体特异性结合反应的特性建立起来的，检测对象主要为血清样品。但是由于血清血凝抑制因子的干扰，可能会导致血凝抑制试验结果假阳性。分子生物学诊断在近几年得到了较快的发展，尤其是实时荧光定量PCR诊断技术已经成为流感实验室检测和快速诊断的国家标准。但由于检测手段繁琐，需要精密仪器，成本较高，限制了其在临床上的应用。
[0004]近年来除了对传统检测方法的发展和完善，纳米技术作为一种新兴的流感病毒检测方法，正在受到人们的更多关注。随着科学技术的发展带动纳米技术的不断发展进步，有关金纳米粒子在生物检测领域的研宄在不断展开与深入，取得了丰硕的成果与长远的发展。金纳米粒子具有独特的光学效应，利用金纳米粒子的SPR性质，当抗原抗体反应引起金纳米粒子聚集形成网络结构后，聚集体在相对较长的波长上对光进行吸收和散射从而使颜色转变为紫红色最后成为蓝色。利用此光学特性的变化，结合生物分子的高灵敏度和特异性，使得金纳米粒子在生物检测上具有广泛而重要的应用前景。
[0005]因此开发一种简单、快速、准确、定量检测临床样本中的流感病毒新方法对于控制流感疫情的发生和蔓延具有重要意义。
【发明内容】
[0006]发明目的:本发明所要解决的技术问题是提供了一种金纳米粒子探针比色法检测甲型流感病毒H3N2的方法。本发明中针对金纳米粒子探针在病毒囊膜表面组装后光学性质发生明显变化，从而建立比色法检测甲型流感病毒，它具有原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，并且实验结果用肉眼便可直接观测而无需任何大型仪器。
[0007]技术方案:为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种金纳米粒子探针比色法检测甲型流感病毒H3N2的方法，包括以下步骤:
O单克隆抗体和甲型流感病毒的选取；
2)金纳米粒子探针的合成；
3)将金纳米粒子探针和甲型流感病毒作用；
4)观察并记录病毒溶液颜色变化情况；
5)利用紫外-可见光谱仪和透射电镜对病毒溶液进行检测。
[0008]其中，上述单克隆抗体为甲型流感病毒H3N2血凝素鼠单克隆抗体。
[0009]其中，上述步骤2)金纳米粒子探针的合成步骤如下:取一 EP管，加入0.5~1 mL，2 nmol/L金纳米粒子溶液，用0.1 mo I/L K2CO3调节溶液的pH值为8.2-9.2，加入0.1 mg/mL的单克隆抗体15~30 μ L，在摇床上120~300转/分钟，37°C下温育1~2小时，然后加入10-20 yL 1% (m/v)BSA，37°C下温育 0.5~1 小时，最后将探针溶液在 12200~13200 rpm,4°C下离心20~30分钟，离心三次后复溶在200~500 μ L PBS缓冲溶液中，4°C保存。
[0010]其中，上述步骤3)金纳米粒子探针和甲型流感病毒作用步骤如下:取金纳米粒子探针加入到甲型流感病毒溶液中，37°C下温育1~2小时后，对其溶液进行记录和紫外-可见光谱检测，取5~10 y L病毒溶液滴加到碳膜支持的铜网上，室温下放置1~3分钟后，用滤纸吸去铜网上剩余溶液，然后将铜网浸于1°/『2%的磷钨酸钠溶液中1~3分钟后，取出，室温下自然晾干，透射电镜检测。
[0011]其中，上述PBS缓冲溶液为含有NaCl和KCl的pH 7.2-7.4的10 mmol/L的PBS缓冲溶液，所述NaCl初始浓度为136.89 mmol/L, KCl初始浓度为2.67 mmol/L。
[0012]其中，上述金纳米粒子直径为13纳米。
[0013]其中，上述甲型流感病毒H3N2在缓冲溶液中的终浓度为0~400 HAU。
[0014]本发明通过一种基于表面修饰甲型流感病毒H3N2血凝素(HA)鼠单克隆抗体的金纳米粒子探针特异性识别甲型流感病毒H3N2囊膜表面的血凝素，金纳米粒子组装到病毒囊膜表面，然后通过病毒囊膜表面金纳米粒子的SPR性质，比色法检测甲型流感病毒H3N2。制备了单克隆抗体修饰的金纳米粒子探针。由于每个流感病毒直径在80~120纳米，囊膜表面含有约500个血凝素，因此囊膜表面血凝素相邻之间约为8纳米，而金纳米粒子的直径为13纳米，大于血凝素相邻间距，因此病毒囊膜表面组装的金纳米粒子可以有效的产生SPR效应，金纳米粒子的SPR吸收峰从525纳米左右红移到600纳米左右，且525纳米处的SPR峰强度减弱，600纳米处的SPR峰强度增加，随着病毒浓度的增大，反应液颜色从酒红色逐渐变为深蓝色。因此本发明利用单克隆抗体的特异性和金纳米粒子的SPR性质，实现比色法检测甲型流感病毒H3N2。
[0015]有益效果:与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点:
(I)本发明利用金纳米粒子探针在甲型流感病毒囊膜表面的组装后，溶液由酒红色变为蓝色，颜色变化明显，因此可用比色法检测甲型流感病毒。
[0016](2)本发明有效利用了纳米材料的特性，不需要借助精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了病毒检测成本，本发明具有成本低、快速、简便、敏感且特异性好的优点。
【附图说明】
[0017]图1显示了基于表面修饰甲型流感病毒H3N2血凝素(HA)鼠单克隆抗体的金纳米粒子探针比色法检测甲型流感病毒H3N2的流程图；
图2A显示了金纳米粒子的透射电镜图；从图中可以看出金纳米粒子粒径均一，分散性好；图28显示了 a线:金纳米粒子的紫外吸收光谱出线:金纳米粒子探针的紫外吸收光谱；从图中可以看出，金纳米粒子探针相对金纳米粒子的紫外吸收光谱没有发生很大的变化，金纳米粒子探针在缓冲溶液中性质稳定；
图3A显示了金纳米粒子探针和甲型流感病毒H3N2组装体的透射电镜图，标尺为50纳米；从图中可以看出金纳米粒子探针成功组装到甲型流感病毒H3N2囊膜表面；图3B显示了 H3N2线:金纳米粒子探针和甲型流感病毒H3N2组装体的紫外吸收光谱control线:金纳米粒子探针在缓冲溶液中的紫外吸收光谱；插图为对应溶液的数码照片；从图中可以看出，当溶液中有甲型流感病毒H3N2时，金纳米粒子探针的SPR吸收峰发生明显红移，对应溶液颜色由酒红色变为蓝色。
[0018]图4显示了检测甲型流感病毒H3N2特异性的紫外光谱变化图和柱状图；A:在不同探针作用下，得到的紫外光谱图(a:金纳米粒子探针与甲型流感病毒H3N2作用；b:表面修饰BSA的金纳米粒子对比探针与甲型流感病毒H3N2作用；c:金纳米粒子探针)，插图为对应溶液的数码照片；从图中可以看出只有单克隆抗体修饰的金纳米粒子探针可以特异性识别甲型流感病毒H3N2 ;B:金纳米粒子探针与不同流感病毒作用后的柱状图；插图为对应溶液的数码照片；从图中可以看出金纳米粒