一种金纳米花免疫探针、其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明特别涉及一种金纳米花免疫探针、其制备方法与应用，属于免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002]金纳米结构由于具有尺寸可控、形状可调等特点，在光学、电学、生物医药和生物传感中获得了广泛的应用。金纳米花(AuNFs)是一种具有多头或枝化结构的特殊的金纳米粒子，相对球形金纳米粒子，其比表面积显著增加。这一特殊的形貌，使得其在生物传感中获得了许多应用。采用方便、可控、生物相容性好的制备方法获得特定形貌的金纳米花，并将其应用于光学、电学、生物医药和生物传感中是一项具有很高应用价值的工作。
[0003]酶联免疫分析(ELISA)技术是一种非常成熟的固相免疫分析模式，在临床诊断、食品安全危害物监测、环境分析等许多领域中已经获得了广泛的应用。但是，酶联免疫分析技术对痕量目标物的检测仍然面临较多的挑战，因此，许多信号放大技术，如银染色增强、酪胺信号放大、免疫-PCR等获得了人们的关注。但是，这些信号放大体系的应用在获得了超高灵敏的检测性能的同时，也使得酶联免疫分析技术的复杂性和成本大大提高，因而限制了它们的实际应用。因而，开发一种制备方法方便、成本低的纳米免疫探针，应用于ELISA，具有较高的应用价值。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种金纳米花(AuNFs)免疫探针、其制备方法与应用。
[0005]为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括:
[0006]在一些实施例中提供了一种金纳米花免疫探针，包括金纳米花粒子以及修饰于金纳米花粒子上的示踪酶标记的抗体；其中所述金纳米花粒子主要是以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得。
[0007]其中，所述示踪酶标记的抗体包括示踪酶标记单克隆抗体或多克隆抗体，所述示踪酶包括辣根过氧化物酶。
[0008]在一些实施例中，所述金纳米花粒子的制备方法包括:
[0009](I)将粒径为10?15nm的金纳米粒子、氧化剂、壳聚糖于水相体系中充分混合后用频率为25kHz?45kHz的超声波处理5?lOmin，制得混合溶液，所述混合溶液中氧化剂的浓度为0.005wt%?0.02wt%，壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的浓度为1.04?4.16mg/mL，所述氧化剂包括氯金酸；
[0010](2)向步骤(I)制备的混合溶液中加入还原剂，直至还原剂的浓度为3.2mM?12.8mM，之后在无光条件下搅拌反应10?15min，制得所述金纳米花粒子。
[0011]其中所述氧化剂包括但不限于氯金酸。所述还原剂包括抗坏血酸或没食子酸，但不限于此。
[0012]对于前述步骤(I)，在一些实施方案之中，可以采取将粒径为10?15nm的金纳米溶液、含量为0.1wt %?4wt%的氯金酸溶液、浓度为5?10mg/mL的壳聚糖乙酸溶液和超纯水混合，之后用超声波处理，制得混合溶液。
[0013]在一些更为具体的实施例之中，所述金纳米花粒子的制备方法可以包括:
[0014](I)将粒径约1nm的金纳米溶液，含量为0.lwt%?4*1:%的氯金酸溶液，以及壳聚糖乙酸溶液混合，并用超纯水定容到24mL后混合均匀，使形成的混合溶液中氯金酸浓度为0.005wt%? 0.02wt%,壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的浓度为1.04?4.16mg/mL，充分混合后用频率为25kHz?45kHz的超声波处理lOmin，制得混合溶液；
[0015](2)向步骤(I)中的混合溶液中迅速加入抗坏血酸，使形成的混合物中抗坏血酸浓度为3.2mM?12.8mM，暗处搅拌反应lOmin，获得金纳米花粒子。
[0016]在一些更为具体的实施例之中，前述的抗坏血酸可替换为没食子酸。
[0017]进一步的，在一些实施例中还提供了由前述任一种方法制备的金纳米花粒子，其具有比表面积大、分散性良好等特性，粒径约30nm?50nm。本发明中由于AuNFs具有极高的比表面积，单个纳米材料可以同时负载多个酶标记抗体分子，进而极大提高免疫探针中酶与抗体的比例，因此，使用包含本发明中AuNFs的免疫探针进行免疫分析，特别是对微量的待分析物进行免疫检测时，可放大免疫检测的信号，提高检测灵敏度。
[0018]在一些实施例中还提供了一种制备所述金纳米花免疫探针的方法，包括:以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得金纳米花粒子，并将金纳米花粒子分散于质量浓度为0.02?0.lmg/mL的辣根过氧化物酶标记的抗体溶液中，在温度为(TC?8°C的条件下震荡Ih?5h，之后加入牛血清蛋白溶液进行封闭，直至牛血清蛋白的最终浓度为0.2wt%?Iwt %，然后在温度为20?27°C、转速为300?600rpm的条件下振荡0.5h?lh，获得所述免疫探针。其中，所述纳米金种子可以采用鞣酸-柠檬酸钠还原法制备。
[0019]在一些实施例中还提供了一种试剂盒，其包括所述的金纳米花免疫探针(如下简称“免疫探针”)。
[0020]在一些实施例中还提供了一种基于所述试剂盒的检测方法(或者也可以认为是所述试剂盒的使用方法)，其包括:
[0021]a、将所述的免疫探针与不同浓度的目标抗原标准样品进行酶联免疫反应，并记录检测信号，由此建立免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系；
[0022]b、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤a建立的免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。
[0023]或者，在一些实施例中，基于所述试剂盒的检测方法也可包括:
[0024]A、将蛋白质与半抗原的偶联物溶于碳酸盐缓冲液中形成包被液，之后加入酶标板中，并在温度为25°C?37°C的条件下孵育I?4h，再以磷酸盐缓冲液洗涤，而后加入封闭液，并在温度为0°C?8°C的条件下封闭过夜，且蛋白质与半抗原的偶联物与碳酸盐缓冲液的体积比为1:9000?1:243000，制得包被抗原溶液，所述蛋白质包括卵清蛋白或牛血清蛋白；
[0025]B、向步骤A中连接上包被抗原的酶标板中加入一系列不同浓度小分子标准品的磷酸盐缓冲液，之后加入含小分子抗体的酶标稀释液，再在温度为25V?37°C的条件下孵育0.5?lh，最后用磷酸盐缓冲液洗涤，所述酶标稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.0lM?0.05M、pH值为7.0?8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1?0.5wt%的明胶和0.05?0.lv/v%的吐温-20，制得多个竞争反应混合体系；
[0026]C、向步骤B制得的各个竞争反应混合体系中分别加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，其中，免疫探针和抗体稀释液的体积比为1:2000?1:3000，之后在温度为25°C?37°C下孵育0.5h?2h，再以磷酸盐缓冲液洗涤，所述抗体稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.0lM?0.05M、pH值为7.0?8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1?0.5wt%的明胶和0.05?0.lv/v%的吐温-20，制得多个混合反应体系；
[0027]D、向步骤C制得的各个混合反应体系中分别加入显色液，之后在温度为25°C?37°C下显色1min?30min，再加入浓度为2M?4M的硫酸溶液，最后测量各混合反应体系在450nm?650nm波长处的吸光值，建立吸光值与抗原量的标准对应关系；
[0028]E、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤D建立的吸光值与抗原量的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。
[0029]在一些实施例中，步骤A所述封闭液包括浓度为0.0Olwt %、分子量为2000?10000的聚乙二醇溶液；
[0030]或者，在一些实施例中，基于所述试剂盒的检测方法也可包括:
[0031]1、将抗体溶于碳酸盐包被缓冲液中，形成蛋白质含量为I μ g/mL?20 μ g/mL的溶液，之后将溶液转入酶标板中，并在温度为25°C?37°C的条件下孵育Ih?4h，再用磷酸盐缓冲液洗涤，最后加入含量为0.1wt %?5wt %的牛血清蛋白溶液，并在温度为0°C?8°C下封闭过夜；
[0032]I1、向步骤I得到的酶标板中加入一系列不同浓度小分子标准品的磷酸盐缓冲液，在