一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉医学检测技术领域，尤其涉及一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，金纳米棒(GNR)引起了科学家深入的研宄兴趣，并得到了大范围的推广应用。在成像领域，金纳米棒的很多光学特性被用来开发体内和体外的成像技术。例如，由于表面等离子体共振效应，金纳米检有具有非常高的光学稳定性和很高的光学吸收和散射效率。事实上，它们比其他形状的纳米棒材料具有更高的光吸收和散射截面积。金纳米棒的长轴等离子体共振吸收峰可以通过改变长径比(长度和直径的比率)简单地从可见光区域调节至近红外光区域，而生物组织在近红外光区域其本上是透明的。通过动态电子弛豫过程，金纳米棒能够将光能转化成热能，从而使他们具有很强的光热转换能力。而且，由于电子空穴的快速结合过程，金纳米棒具有很高的光致发光的量子产率，其最大发射波长可以通过增大长径比进行增加。上述特点已应用于各种成像模式，包括光散射成像、光吸收成像、光热成像、光声成像和荧光成像等等。但是还有一个很重要的光学特性没有得到充分的重视，即金纳米棒能够改变入射光的偏振特性，迄今为止，还没有文献报道利用这种光去极化性质来开发新的成像方法。
[0003]偏光显微镜是一项非常好的工具，能够同时提供物理的、化学和晶体数据。在这种简单的技术中，使用偏振光对样品进行照射，而反射光和透射光使用偏振方向垂直于入射光偏振方向的检偏器来阻断。偏光显微镜能够选择性的观察各向异性的化合物和结构，被检测目标在这种情况下是明亮的。这种技术能够对诸如纺锤体之类的双折射结构提供高分辨率的成像，而这种结构在Hoffman，暗场和相差显微镜下是看不到的。偏光显微镜对评估人体的微环境是非常有用的，能够通过减少细胞组份的散射和周围组织的污点得到较高的图像对比度和细节。
[0004]有研宄表明:利用暗场显微镜和垂直偏振成像技术可以提供原位高信噪比星型金纳米颗粒的图像，实时追踪单个纳米颗粒的行为能对物理学和生物学过程提供丰富的细节信息。迄今为止，普通的偏光显微镜还没有在实验中用来观察单个纳米颗粒，主要原因是:一方面由于其他显微成像技术的存在，利用偏光显微镜进行材料分析的意识越来越少；另一方面，纳米颗粒都在纳米尺度，因为尺寸太小了，如果纳米材料没有非常强的光学性能是很难被观测到的。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法，由于偏光显微镜具有很强的减背景能力，细胞内单个金纳米棒可以被清楚地观察到，金纳米棒与偏光显微镜可联合应用于癌症检测和新型传感器的开发。
[0006]本发明的采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法的具体步骤如下:
[0007]将细胞置于放置了玻片的塑料培养皿中，注入高糖DMEM培养基进行培养，使用I %的青霉素-链霉素，10%的牛血清在37°C，5% CO2环境中进行培养，当细胞培养24h后，溶液采用新的高糖DMEM培养基进行替换，并加入40ul抗体修饰的金纳米棒溶液，再经过4h的培养后，将盖玻片从培养皿中取出并倒置于载玻片上进行观察，成像使用Olympus BX51显微镜，显微镜装置100W的齒素鹤灯、一个NA值为1.25-1.36的油浸式聚光镜、40倍的平场消色差聚光镜和型号为Olympus DP73的彩色CXD ((XD为电荷耦合元件)，盖上盖玻片后，快速置于偏光显微镜下进行观察，当偏光显微镜用于颗粒成像时，起偏器应该慢慢地旋转直到视场完全变黑；然后，再逐渐调节焦面来找到金棒，拍照时采用400ms的曝光时间。
[0008]所述抗体修饰的金纳米棒溶液的制备方法如下:
[0009]I)合成金纳米颗粒种子:在血清瓶中，将48 μ L 0.1M冰的硼氢化钠注入含有0.1MCTAB和0.00025Μ的HAuCl4 4mL溶液中，应用前溶液需在28°C溶液中静置2h以上；
[0010]2)在 20mL 的 0.1M CTAB 溶液中，依次加入 426 μ L 24.28mM 的 HAuC14、0.5ml 4mM的AgNOjP 105 μ L 0.1M的ΑΑ，待溶液从黄色转化为无色时，加入60 μ L种子溶液并振荡20-30s ;然后在溶液中静置4h以上；最后将3ml新合成的金纳米棒溶液加入到20mL含有0.1M CTAB, 80 μ L 24.28mM HAuCljP 185 μ L 0.1M AA 溶液中，溶液振荡 30s 后静置 2h，得到的产品在1000rpm下离心并去除上清液两次，新制备的金纳米棒用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
[0011]3)球状纳米颗粒按照以下方法合成:2mL 24.28mM HAuCl4加入到93mL去离子水中，在回流状态下将溶液加热至沸腾，然后加入5mL I %的柠檬酸钠溶液，并继续加热30min，待溶液冷却至室温后得到40nm的金纳米颗粒，样品用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
[0012]本发明的有益效果如下:
[0013]I)偏光显微镜能够明显降低环境的背景。
[0014]2)偏光显微镜下光点的直径要比暗场显微镜下的要小。
[0015]3)虽然金纳米棒的乐强不同，但是信噪比得到明显的增加。
[0016]4)细胞环境下的金纳米棒被清晰地观察到。金纳米棒与偏光显微镜的联合应用在癌症检测和开发新的传感器方面具有十分重要意义。
【附图说明】
[0017]图1:金纳棒的紫外可见吸收光谱图。
[0018]图2:金纳米球的紫外可见吸收光谱图。
[0019]图3:金纳棒的透射电子显微镜图像。
[0020]图4:金纳米球的透射电子显微镜图像。
[0021]图5:金纳米棒和金纳米球在暗场显微镜下和偏光显微镜下的图像。
[0022]金纳米棒在暗场显微镜下㈧和偏光显微镜下⑶的的图像，蓝色圆圈中在暗场下呈红色的点在偏光显微镜看不到，是因为金纳米棒的方向与偏光器和检偏器是一致的。绿色的点可能是金纳米颗粒，它们没有光去极化功能，在偏光显微镜下是看不到的；金纳米球在暗场显微镜下(C)和偏光显微镜下(D)的散射图像，白色圆圈中黄色的点是金纳米颗粒的具集体他们可以改变光的偏振方向；图中E和F分别为图A和B方框中的点的放大图和它们的光强的表面图。
[0023]图6:用EGFR抗体修饰的金纳米棒选择性地对HeLa细胞进行高信噪比成像图。
【具体实施方式】
[0024]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0025]实施例
[0026]1、试剂
[0027]柠檬酸钠、氯金酸(99.99 %，HAuCl4.3H20)、十六烷基三甲基溴化铵(99 %，CTAB)均购自上海国药公司；硼氢化钠(98%，NaBH4)、抗坏血酸(99.7%，AA)、硝酸银(99.8%，AgNO3)、巯基^^一烷基三甲基溴化铵(99%，MUTAB)购买于Sigma-Aldrich公司。上述试剂在使用时使用超纯水进行配制。
[0028]所有玻璃器皿均用王水(体积比HCl = HNO3= 3:1)进行浸泡清洗。
[0029]2、抗体修饰的金纳米棒的合成
[0030]I)合成金纳米颗粒种子:在血清瓶中，将48 μ L 0.1M冰的硼氢化钠注入含有0.1MCTAB和0.00025Μ HAuCl4 4mL溶液中，在使用前，溶液需要在28°C溶液中静置2h以上。
[0031]2)在 20mL 0.1M CTAB 溶液中，依次加入 426 μ L 24.28mM HAuCl4, 0.5ml 4mMAgNOjPlOSyL 0.1M AA ;待溶液从黄色转化为无色时，加入60 yL种子溶液并振荡20-30s ;然后在溶液中静置4h以上；最后，将3ml新合成的金纳米棒溶液加入到20mL含有0.1M CTAB, 80 μ L 24.28mM HAuCljP 185 μ L 0.1M AA 溶液中；溶液振荡 30s 后静置 2h ;得到的产品在1000rpm下离心并去除上清液两次。新制备的金纳米棒用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
[0032]3)球状纳米颗粒按照以下方法合成:2mL 24.28mM HAuCl4加入到93mL去离子水中，在回流状态下将溶液加热至沸腾；然后加入5mL I %的柠檬酸钠溶液，并继续加热30min ;最后，待溶液冷却至室温即得到40nm的金纳米颗粒。样品用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
[0033]3、单个金纳米棒和纳米颗粒成像
[0034]成像实验在Olympus BX51显微镜上进行操作。显微镜需要装置100W的卤素钨灯，一个NA值为1.25-1.36的油浸式聚光镜、40倍的平场消色差聚光镜和型号为OlympusDP73的彩色CCD。为了进行单个金纳米棒和金纳米颗粒的成像，将制备得到的溶液稀释40倍，并将20uL溶液滴在载玻片上，然后盖上盖玻片后，快速置于暗场显微镜和偏光显微镜下进行观察。当偏光显微镜用于颗粒成像时，起偏器应该慢慢旋转直到视场完全变黑。然后，再逐渐调节焦面来找到金棒。拍照时采用400ms的曝光时间，最终得到的数据用ImageJ，Excel和Origin进行处理分析。
[0035]4、细胞培养和细胞环境下金纳米棒的成像
[0036]实验中用到的HeLa细胞购自美国典型菌种收藏所。将细胞置于放置了盖玻片的塑