纳米探针的制备方法、基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种靶向纳米探针的制备方法、基于天然产物单 体和纳米探针的纳米药物的制备方法及应用，以纳米探针GC-QDs为载体，负载天然产物单 体之后制备成具有荧光性质的靶向纳米药物，可用于肝细胞性肝癌的诊断标记和治疗。
【背景技术】
[0002] 肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC)是由病毒和化学致癌物等多因 素的作用引起肝细胞生长失控而致癌变。HCC恶性程度极高，预后很差，早诊早治是提高 HCC患者生存率的唯一途径。GPC-3的表达与肝细胞癌的形成关系密切，具癌胚性，可作为 早期HCC的血清标志物和潜在的靶向治疗目标。通过建立高特异性和高灵敏度的GPC-3监 测方法，可有望实现靶向HCC的准确诊断和及时治疗。
[0003] 雷公藤红素是一种具有显著抗肿瘤活性的天然活性单体。由于雷公藤红素的毒副 作用也相对较大，因此，对雷公藤红素的结构优化以及剂型的改造是得到具有高效低毒特 性的抗肿瘤化合物的重要途径。关于雷公藤红素新剂型的研究，目前报道不多，主要包括 口服自微乳以及固体脂质纳米粒等几种剂型，通过表面负载的方式制备纳米药物的研究不 多。
[0004] 量子点可以作为一种理想的荧光探针以及纳米载体材料，可用于疾病的诊断、治 疗及药物研发等研究领域。但是常用量子点的细胞毒性较大，生物安全性和生物靶向性较 差。通过结构改造和功能化修饰，可以显著改善量子点的诸多缺点，进而应用到生物医学的 研究领域。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种纳米探针的制备方法、基于天然产物单体和 纳米探针的纳米药物的制备方法及应用，制备的纳米药物更有利于药物的释放，提高药物 利用率，并且表面修饰之后，纳米探针的荧光特性没有影响。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种纳米探针的制备方法，所述纳米 探针以ZnS为壳层的核壳结构的荧光量子点为载体，通过表面修饰单抗GC-33制备得到，其 制备步骤如下： (1-1)制备以ZnS为壳层的核壳结构量子点； (1-2)取2~10 ml以ZnS为壳层的核壳结构量子点溶液超生分散，15000 rpm转离心 30~50 min，加超纯水0. 5 ml，备用； (1-3)取5~20 mg的碳化二亚胺，l~10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺加水I. 0 ml溶解； (1-4)取上述溶液0. 3~1. 0 ml加入以ZnS为壳层的核壳结构量子点溶液中，定容至 I. 0~5. 0 ml，37°C摇床反应1~2小时； (1-5) 15000 rpm高速离心30~50分钟，弃上清，用pH 8. 5的PBS溶液250~1000 μ 1 重新溶解； (1-6)加5~20 μ 1的靶向GPC-3的单抗GC-33溶液，37°C的恒温下，摇床反应2~3小 时，将单抗GC-33修饰到以ZnS为壳层的核壳结构量子点的表面； (1-7)15000 rpm离心30~50分钟，溶于pH 7. 2的PBS溶液中，分离提纯得到靶向肿瘤 标志物GPC-3的荧光纳米探针。
[0007] 其中，所述步骤（1-1)中的以ZnS为壳层的核壳结构量子点为ZnO/ZnS，具体制备 步骤如下： (2-1)将3~8g乙酸锌和0. 3~1. 5g乙酸钠加入到装有200mL乙醇的圆底烧瓶中； (2-2)加热溶解后，迅速加入I. 0 mol/1的氧化钠乙醇溶液18~50 mL，反应30~60分 钟，冷却至室温； (2-3)在溶液中以0. 5~2. 0滴/秒的滴速滴加过量乙酸乙酯至有沉淀产生，离心分离 出沉淀物，用乙酸乙酯洗涤3~5次，然后把沉淀物重新分散在乙醇中，制得ZnO纳米颗粒； (2-4)向ZnO纳米颗粒的悬浮液中依次滴加0. 2 mol/1的乙酸锌3~10 ml和等体积的 0. 2 mol/1的硫代乙酰胺的乙醇溶液，滴速保持0. 5~2. 0滴/秒，滴加完成后加热； (2-5)按照S-Zn-S-Zn逐层对其进行ZnS壳层包覆，形成ZnO/ZnS量子点，反应4~8小 时后终止，再次使用乙酸乙醋沉淀出不同粒径的ZnO/ZnS核壳纳米颗粒，离心分离出ZnO/ ZnS核壳结构量子点。
[0008] 本发明还提供一种基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法，通过酰 胺化反应，将天然产物单体与氨基化PEG连接成药物分子-PEG的聚合物，然后通过相转移 的方法将该聚合物连接到量子点表面，进而形成具有靶向性的荧光纳米药物。
[0009] 上述纳米药物的制备方法包括如下步骤： (3-1)以ZnS为壳层的核壳结构量子点为载体，通过表面修饰单抗GC-33制备靶向肿瘤 标志物GPC-3的荧光纳米探针GC-QDs 1~10 ml ; (3-2)取天然产物单体配置成I. 0~10. 0 mg/ml的药物溶液，备用； (3-3)取5~15mg的碳化二亚胺、1~5 mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺加水I. 0~5. Oml溶解； (3-4)取步骤（3-3)所制溶液0. 5 ml，加入到0. 3~1.0ml按步骤（3-2)配置的药物溶 液中，定容至I. 0 ml，37°C摇床反应1~3小时； (3-5)向上述混合溶液中以1~2滴/秒滴加2mg/ml的氨基化PEG溶液l~5ml，然后在 37°C的恒温下反应2~4小时，搅拌速度200~1000转/min，制备成药物分子-PEG的聚合物， 纯化后用PBS重新溶解，备用； (3-6)将药物分子-PEG的聚合物溶液与步骤（3-1)配置的纳米探针GC-QDs溶液，按照 等质量浓度混合，室温下搅拌反应3~6小时，将药物分子连接到纳米探针的表面； (3-7)15000 rpm离心30~50分钟，收集上清液，并将沉淀物重新溶于PBS中，制成靶向 GPC-3的荧光纳米药物GC-QDs-Drug。
[0010] 其中，所述步骤（3-1)中纳米探针GC-QDs的制备步骤参照前面所述。
[0011] 本发明还提供一种上述的纳米药物的应用，包括纳米药物体外药物控制释放曲线 的测定、纳米药物对体外培养的肝癌细胞HepG2生长抑制率的测定、纳米药物促进肝癌细 胞H印G2凋亡的体外测试实验、纳米药物对肝癌细胞的标记。
[0012] 本发明的上述技术方案的有益效果如下： 1.本发明通过简单可行的方法将天然产物单体负载到纳米探针的表面，相比于常用 的口服自微乳、固体脂质纳米粒等几种剂型，该微纳结构的纳米药物更有利于药物的释放， 提高药物利用率，并且表面修饰之后，纳米探针的荧光特性没有影响。
[0013] 2.本发明所制备的荧光纳米药物具有较高的载药率（20. 31±6. 76%)和包封率 (82. 85± 10. 33%)，且体外药物释放呈现pH敏感性，相比于pH7. 4的环境，在pH6. 0的酸性 介质中，纳米药物具有更快的药物释放速度和药物释放率，这一特性减少了纳米药物在体 循环中的药物释放量和毒副作用，同时有利于在肿瘤部位的被动靶向作用。
[0014] 3.本发明所制备的靶向荧光纳米药物可对肝癌细胞进行荧光标记和成像，通过 对癌细胞的标记、示踪和治疗的一体化动态监测，发展基于新型标志物GPC-3标记和成像 指导下肝癌的准确治疗。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明的荧光纳米药物在不同pH值的介质中，对雷公藤红素分子的体外药 物释放曲线； 图2是本发明中肝癌细胞经过纳米药物干预之后产生明显凋亡的DAPI染色结果； 图3是本发明的纳米探针及荧光纳米药物对肝癌细胞的体外荧光标记实验结果图。
【具体实施方式】
[0016] 为了便于理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述，但本发