二氧化硅纳米颗粒及其用于疫苗接种的用图
【专利说明】二氧化硅纳米颗粒及其用于疫苗接种的用途
[0001] 本申请是申请号为200980127650. X的中国专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及由二氧化硅构成的超小型、单分散的纳米颗粒，在其表面固定有至少 一种抗原。该纳米颗粒可以用于癌症的免疫预防或免疫治疗。本发明的主题还在于将抗原 靶向到抗原呈递细胞并用于活化免疫系统的方法，其中通过颗粒特性调节靶向和/或免疫 活化的效率。本发明还涉及用于哺乳动物的主动和被动免疫的方法。
[0003] 动物或人类有机体的健康尤其取决于，有机体以何种程度能够自我防护源于周围 环境的致病因素或者有机体以何种程度能够识别和清除改变的自体材料。满足这些功能的 人体或动物体的免疫系统能够分为两个功能范围：先天性的和获得性的免疫系统。先天性 免疫力是针对感染的第一道防线，并且在病原体例如造成可识别的感染前，使大多数潜在 的病原体变得无害。获得性免疫系统对被称为抗原的侵入的有机体或改变的自体材料的表 面结构做出反应。
[0004] 有两种类型的获得性免疫反应：体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在体液免 疫反应中，在体液中的已有抗体与抗原结合并导致其失活。在细胞介导的免疫反应中，T细 胞能够主动破坏其它细胞。例如当在细胞中存在与疾病相关的蛋白时，它们在细胞内部被 片段化地蛋白水解成肽。然后特异性细胞蛋白结合到如此产生的蛋白或抗原的片段上并将 其转运到细胞表面，在该处它们被呈递到分子的防御机制，尤其是机体的T细胞。
[0005] 将肽转运到细胞表面并在该处呈现的分子被称为主要组织相容性复合物（MHC) 蛋白。MHC蛋白的意义还在于，其允许T细胞将自身抗原区别于非自身抗原。例如在使用肽 疫苗的情况下，此类非自身肽序列的识别使得操纵免疫系统对抗患病细胞成为可能。
[0006] 在疫苗领域中用于呈递蛋白源抗原或肽抗原的技术必须满足两个基本任务：将抗 原有效地转运到树突状细胞和树突状细胞随后活化以产生获得性免疫应答。目前的疫苗发 展关注于分子策略，其针对例如在皮肤或肌肉中作为靶的外周树突状细胞。特别地，通过抗 体（该抗体对树突状细胞的细胞表面受体是特异性的，并且，或者与抗原融合，或者在颗粒 表面聚集），将抗原指引到其树突细胞的特定部位。此类高要求的细胞特异性靶向的构建不 是强制性的，尤其如Fifis等人，（2004) J Immunol. 173 (5)，3148所能指出的，其通过将与 银缀合的聚苯乙稀小球转运到树突状细胞产生免疫应答。
[0007] 此外，在免疫学中已知的是，使用佐剂以便非特异性提高针对所给物质的免疫应 答。在抗原产生特异性免疫应答期间，基本上是佐剂负责该应答的强度。为了产生获得性免 疫应答，使用佐剂诱导树突状细胞成熟是不可缺少的。在此，树突状细胞成熟是分子危险信 号的结果，所述分子危险信号通过先天性免疫的信号通路产生，例如，Tol 1样受体（TLRs) 或炎性细胞因子受体。例如WO 2004/108072 A2中描述了一种缀合物，其中将免疫应答修饰 的化合物，例如TLR激动剂，连接在金属颗粒载体上，该载体还具有至少一种活性物质。免 疫应答修饰的化合物在此理解为疫苗的佐剂，其虽然引起细胞毒性淋巴细胞强烈活化，但 却使颗粒构建及其经济制备变得复杂和随之产生增高的毒性风险和生理学上的运输限制。
[0008] WO 2001/12221 Al描述了与蛋白原性抗原、细胞或细胞碎片结合的二氧化硅的固 有佐剂效应，该效应基于粗糙的棱角和不规则的形态，因此允许细胞膜的穿透和表面蛋白 的修饰。与此相反，WO 2007/030901 Al 和 Vallhov 等人，（2007) ,Nano Lett. 7 (12) ,3576 将 佐剂效应与二氧化硅颗粒的中孔度（MesoporosiGt)相关联。独立于基本原因 ，EP 〇 465 081 Bl已教导了一种制剂，其包含由金属、陶瓷（例如二氧化硅）或聚合物组成的核心 部分、至少部分覆盖该核心部分表面的包衣（该包衣包括基糖、改性的糖或寡核苷酸），和 与被包覆的核心部分保持接触的至少一种病毒蛋白或肽。核心部分具有10-200nm的直径， 但也可凝集成更大的颗粒，这甚至是可以期望的，因为由此出现储藏效应（Depotwirkung)。 不利的是，通过这种凝集不能产生药学上稳定的悬浮液，也不能提供可无菌过滤性。
[0009] 本发明的任务在于克服现有技术中出现的缺点并开发纳米颗粒，该纳米颗粒具有 单分散的粒径并使在免疫预防或免疫治疗上的有效应用成为可能，特别是作为疫苗，其在 降低副作用的同时，改善治疗的有效性。
[0010] 本发明任务根据独立权利要求得以解决。从属权利要求包含优选的具体实施方 式。根据本发明，提供包含基质的纳米颗粒，该基质包含超过50%的二氧化硅，其中该二氧 化硅具有至少一种表面官能团，在该表面官能团上固定有至少一种抗原，并且其中纳米颗 粒具有5-50nm的粒径。在此，如此解释粒径，在整个5-50nm的范围内不存在随机分布，而 是在上述范围内选择预定的粒径，其标准偏差最大为15%，优选最大为10%。在本发明的 一个【具体实施方式】中，颗粒的粒径为10_30nm，优选20-30nm，特别优选13-29nm，完全特别 优选 25nm±10%。
[0011] 令人惊奇地显示，通过在5-50nm的狭窄粒径范围内提供二氧化娃纳米颗粒，抗原 靶向到抗原呈递细胞的效率可以明显提高。特别是，不再靶向浅表外周的树突状细胞，而是 靶向淋巴结中的那些树突状细胞。依据其粒径和材料选择如此构造根据本发明的纳米颗 粒，使得树突状细胞的成熟被高效诱导。该诱导特别在补体系统活化下发生。鉴于靶向到 具有高树突状细胞密度的淋巴结和鉴于作为T细胞增生和免疫的前提条件的树突状细胞 成熟的途径，根据本发明的二氧化硅纳米颗粒由此展现了全新的可能性。值得注意的是，出 现了基于该纳米颗粒的疫苗，该疫苗在免疫接种中无需常规不可缺少的佐剂。
[0012] 目前，仅由US 6, 086, 881可知，疫苗材料应具有大的分子量，这提高针对抗原决 定簇的概率。同样期望的是，将疫苗材料聚集到或吸附到明矾或其它凝胶上，因为细胞表面 分子的细胞连接和刺激会通常变得更有效，以及由于缓慢的解吸附速率，抗原在较长的时 间间隔中保留在组织中。这也通过Vallhov等人，（2007)，Nano Lett. 7(12)，3576,证实， 由中孔二氧化硅构成的较大颗粒对由单核细胞衍生的人树突状细胞具有较大影响。此外， 在本领域中根据WO 2008/019366 A2描述了用于靶向抗原呈递细胞的抗原-二氧化硅-缀 合物，对于该缀合物，0. 3-20 μ m的粒径被视为是对于吞噬作用所必须的前提条件。与此相 反，本发明揭示了，恰恰是二氧化硅纳米颗粒以所定义的5-50nm的狭窄粒径范围能够用于 被动靶向到抗原呈递细胞和用于补体活化。
[0013] 在本发明的意义中，"抗原呈递细胞"理解为可以诱导将抗原呈递到T细胞的各种 细胞，其中也包括前体细胞，其可以分化成抗原呈递细胞并可以活化。抗原呈递细胞包括树 突状细胞、朗格汉氏细胞、PBMCs、巨噬细胞、B-淋巴细胞或其它活化或修饰的细胞类型，如 上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞，MHC分子在其细胞表面表达，优选树突状细胞，特别优选 淋巴结的树突状细胞。抗原呈递细胞的前体包括CD34+细胞、单核细胞、成纤维细胞和内皮 细胞。
[0014] 根据本发明，颗粒状的连接基质包含大于50%的二氧化硅。连接基质也可以和其 它组分混合，其中在多组分体系中二氧化硅显示最高的组分。对于其它组分的实例是金属、 金属衍生物、金属氧化物、聚合物、有机硅烷、其它陶瓷或玻璃。然而，在本发明的一个实施 方案中，作为其它组分，排除聚合物。优选的是，所述基质包含直至至少80 %的二氧化硅，特 别优选至少90 %。在本发明的一个完全特别优选的【具体实施方式】中，纳米颗粒包含基本上 是纯的二氧化硅基质，即其仅具有制备方法过程中预期的杂质。在本发明最优选的具体实 施方式中，颗粒状的连接基质由二氧化硅组成。
[0015] 为了制备颗粒尤其还提供了经典的St0ber合成，其中通过在水-醇-氨碱 性介质中水解四乙氧基硅烷（TEOS)，可以制备预定粒径的单分散的、纳米级二氧化硅 (J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62)。发明人可以令人惊奇地显示，尽管表面官能化， 但纳米颗粒的稳定性仍然保留，由此获得不倾向于聚集的单分散颗粒。根据本发明因此优 选纳米颗粒，其根据具有以下步骤的方法制备：
[0016] (a)在含有水、至少一种增溶剂和至少一种胺或氨的介质中水解缩聚四烷氧基硅 烷和/或有机三烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子的溶胶，并随即通过连续地、按照终止 反应措施地控制地计量加入相应的硅烷阻止进一步成核，使获得的纳米颗粒达到在5-50nm 范围内的所期望的粒径，和
[0017] (b)将抗原固定在所述纳米颗粒的表面官能团上。
[0018] 如果氨是介质的成分，则特别使用醇作为增溶剂，从而在水-醇-氨介质中进行反 应，就此获得高分散的颗粒，其平均粒径的标准误差不超过10%。目前发明人意外地发现， 采用这种方法甚至实现具有所期望的单分散特性在50nm以下的粒径。该方法的步骤（a) 已描述于EP 0 216 278 BI和WO 2005/085135 Al中，因此这些文献以其整体被引入本申 请公开中作为参考。优选在介质中使用至少一种胺。
[0019] 根据本发明的纳米颗粒的二氧化硅基质既可以是有孔的也可以是无孔的。孔度基 本上取决于制备方法。参见根据EP 0 216 278 Bl的合成特别得到无孔的颗粒。在5-50nm 的起始范围内，对于无孔纳米颗粒优选的粒径为l〇-30nm，而对于有孔颗粒优选的粒径为 10-40nm。本发明的优选颗粒是固体。
[0020] 在本发明中，"纳米颗粒"被理解为在其表面上具有官能团的颗粒状的连接基质， 其对于最终待连接的或待吸附的抗原作用为识别部位。所述表面在此包括所有的面，即除 了外表面外，还有颗粒中空腔（孔）的内面。在根据本发明的实施方案中抗原因此可以收 纳于颗粒中，这以二氧化硅基质的孔度为先决条件。
[0021] 表面官能团可以不仅由一种或多种化学基团组成，其可以是相同的或不同的，其 中所述基团或者以其特性作为接头允许纳米颗粒与抗原的特异性固定，或者形成用以固定 的非特异性的Z电势（Zetapotential)。
[0022] 术语"固定"此处是指在表面官能团和抗原之间的各种类型的相互作用，特别是 共价或非共价连接，如共价连接、疏水/亲水相互作用、范德华力、离子键、氢键、配体-受 体-相互作用、核酸的碱基配对或者表位和抗体结合位点间的相互作用。
[0023] 在本发明优选的【具体实施方式】中，抗原与纳米颗粒共价连接。共价连接可以直接 或间接进行。在直接的变化形式中，将抗原直接缀合到颗粒上的化学基团上，这大多以位 点非特异性的方式发生，并可使在抗原呈递细胞的吞噬体中的随后释放变得困难。在本发 明的实施方案中期望的是，排除硫醚、碳水化合物和/或寡核苷酸作为表面官能团。共价 连接的非直接方法使用接头或标记，通过其将抗原位点特异性地连接到颗粒上，并受控地 再次释放。位点特异性缀合的标记在本领域是已知的，如SNAP-标记、Halo-标记、C-末端 LPXTG-标记、生物素-受体-肽、PCP或ybbR-标记，并且尤其描述于WO 2008/019366 A2 中，使得这些文献以其整体被引入到本发明的公开内容中作为参考。该参考也适用在本申 请文献中所有关于这些文献的进一步提及。
[0024] 在表面官能团的优选的【具体实施方式】中，其通过不稳定的接头呈现，特别优选通 过腙接头、二硫化物接头或酶易接近的肽序列。在第一临床候选物中，多柔比星经酸不稳定 的腙连接作为预期断裂点与聚合物连接（Angew. Chem. 2006, 118,