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[0068] (a)提供含有基本上纯的二氧化硅的纳米颗粒，该纳米颗粒具有表面官能团，在该 表面官能团上固定有至少一种抗原，
[0069] (b)将所述纳米颗粒施用给在细胞培养物、组织、器官或哺乳动物中含有的抗原呈 递细胞，
[0070] (C)以如下方式将抗原经组织间液靶向到抗原呈递细胞：通过纳米颗粒的粒径调 节靶向效率，两者至少部分地呈反比。
[0071] 在本发明方法的步骤（a)中，纳米颗粒优选通过以下步骤提供：
[0072] (a'）在含有水、至少一种增溶剂和至少一种胺或氨的介质中水解缩聚四烷氧基硅 烷和/或有机三烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子的溶胶，并随即通过连续地、按照终止 反应措施地控制地计量加入相应的硅烷阻止进一步成核，使获得的纳米颗粒达到所期望的 粒径，和
[0073] (a"）将至少一种抗原固定在所述纳米颗粒的表面官能团上，和任选地
[0074] (a"'）分散纳米颗粒。
[0075] 在根据本发明方法的步骤（b)中，纳米颗粒优选施用给动物，特别优选哺乳动物， 完全特别优选人类。特别是进行肠胃外，特别优选皮内或皮下给药。
[0076] 目前在步骤（C)中出乎意料地显示，可以通过纳米颗粒的粒径影响二氧化硅颗粒 的革巴向。当约150nm的粒径是上限时，在该上限处还观察到一些革El向，而在较小的粒径时革巴 向效率提高。颗粒的粒径范围优选大于Onm小于150nm，特别优选5-50nm，完全特别优选 10-30nm，最优选 13-29nm。
[0077] 在本发明的【具体实施方式】中，靶向效率和纳米颗粒在整个范围内呈反比。效率可 在此线性和非线性地提高，优选非线性。
[0078] 在本发明另一【具体实施方式】中可能的是，靶向效率和粒径之间的反比例不在整个 粒径范围内显示，而是并非在最小的粒径（并由此在粒径范围的端点）时观察到与本发明 相关地接近靶向效率的最大值。在根据本发明方法的实施方案中，优选通过具有大于/等 于2的自然偶次幂的幂函数描述靶向效率（在纵坐标上）对粒径（在横坐标上）的依赖性， 其抛物线向下开口，使得顶点是最大效率。二次函数是特别优选的。换言之，在0_150nm的 上述粒径范围内直至顶点（转折点）观察到反比例。
[0079] 按照该方法可以针对性地调节部分靶向或达到靶向最大化。在本方法的具体实施 方式中，超过50 %的抗原呈递细胞导向到淋巴结，优选超过70 %，特别优选超过85 %，完全 特别优选超过95%。反之，为此优选，使用具有5-50nm粒径的纳米颗粒。粒径包括至少二 氧化娃基质，优选整个纳米颗粒。
[0080] 在根据本发明方法的另一实施方式中，在步骤（C)之后还有其它步骤：
[0081 ] (d)将纳米颗粒摄入抗原呈递细胞，和任选地
[0082] (e)在胞内体中释放抗原。
[0083] 优选的是，在步骤（c)之后进行步骤（d)和步骤（e)这两个步骤。在细胞内吞作 用后颗粒状结合基质释放抗原的动力学可以在步骤（e)中控制，其中抗原通过所谓的可裂 解的接头共价连接到载体上。例如可以构建pH敏感键、酶切位点（如蛋白酶敏感的接头） 和/或还原性或氧化性可裂解的接头作为表面官能团。本发明优选的pH敏感键通过某些 酯、二硫化物键、腙接头、酸酐连接、自我裂解的内蛋白序列、PH-敏感的螯合剂或聚合物，如 聚乙烯氧化物改性的聚-β-氨基酯来实现。对于步骤（e)，通过不稳定接头作为表面官能 团的抗原的共价连接是必要的，其中腙接头、二硫化物接头或酶易接近的肽序列是优选的。 此外优选的是，抗原在早期胞内体中释放。
[0084] 本发明的前述教导及其涉及纳米颗粒、其分散体、药物制剂和应用的具体实施方 式是有效的，且不限于可用在将抗原靶向到抗原呈递细胞的方法上，只要这看起来是有意 义的。
[0085] 本发明另一目的还在于在哺乳动物中活化免疫系统的方法，在该方法中，在第一 步骤（a)中根据如上所述的本发明的方法将纳米颗粒导向抗原呈递细胞，并且在第二步骤 (b)中活化免疫系统。优选活化补体系统。在步骤（b)中，活化效率可以通过颗粒特性调 节，为此特别考虑粒径、表面官能团、表面电荷和种类、比例、配体（如抗原、PEG、佐剂）的数 量和密度。在步骤（b)中优选的是，活化效率通过粒径调节，两者至少部分地呈反比。特别 是，活化效率随粒径减小而升高。本发明的前述教导及其涉及将抗原靶向到抗原呈递细胞 的方法的【具体实施方式】是有效的，且不限于可用在哺乳动物中用于活化免疫系统或补体系 统的方法上，只要这看起来是有意义的。
[0086] 本发明此外教导了免疫（Vakzinierung)，其中将有效量的根据本发明的纳米颗粒 和/或具有该颗粒的分散体施用给需要此类治疗的哺乳动物。待治疗的哺乳动物优选是 人。本发明的前述教导及其【具体实施方式】是有效的，且不限于可用在治疗方法上，只要这看 起来是有意义的。
[0087] 本发明进一步教导了诱导T细胞应答、抗体应答和/或树突状细胞成熟的方法，其 特征在于，将作为分散体和/或药物制剂存在的根据本发明的纳米颗粒施用给哺乳动物， 并诱导T细胞和/或树突状细胞的增殖和/或中和抗体的形成。在本发明中，优选的有机 体是人类或动物。由于根据本发明纳米颗粒的公开，使本领域技术人员能够将其用于诱导 T细胞和/或中和抗体。
[0088] 在此，本领域技术人员已知的是，可以将本发明的纳米颗粒（其明显还可作为根 据本发明的药物制剂使用）以各种剂量施用给有机体，特别是人类患者。在此应如此施用， 使得产生尽可能大的量的T细胞和/或中和抗体。施用的浓度和类型可由本领域技术人员 通过常规实验确定。
[0089] 与纳米颗粒或其药物制剂接触可以进行预防或治疗。例如预防接种，以便在病毒 性传染病之前产生主动接种防护，应至少如此阻止病毒感染，使得在单次病毒入侵后，例如 在伤口中，强烈减少病毒的进一步增殖，或几乎完全杀死入侵的病毒。在免疫应答的治疗性 诱导中，患者已存感染，进行T细胞和/或中和抗体的诱导，以便杀死已在机体中存在的病 毒或抑制其扩增。
[0090] 本发明的另一目的在于有机体的被动免疫，其特征在于，获得通过将根据本发明 的纳米颗粒施用于哺乳动物而诱导的T细胞和/或抗体，并将其施用于其它哺乳动物。本 发明中"其它哺乳动物"是指同类的和不同类的有机体，虽然不是同类有机体，但其诱导所 述的T细胞和/或抗体。也可获得单克隆抗体，尤其在相应的人源化后使用。此外同样可 以从接种的或感染的个体中获得产生抗体的细胞，该细胞产生中和抗体，该中和抗体针对 本发明的纳米颗粒，并且以单克隆抗体的形式在被动免疫中施用。
[0091] 在被动免疫的情况下，在患者机体中，例如对于某些病毒基本上不产生自身的免 疫反应，而是将T细胞和/或抗体例如以血清的形式输给患者。被动免疫具有与主动免疫 相反的任务，尽可能快地治愈已发生的感染，或立即保护免于病毒感染。对于本领域技术人 员而言，例如针对甲肝、乙肝或FSME的用于被动免疫的各种免疫计划是已知的。此类免疫 计划可以通过针对特殊的逆转录病毒，如HIV、猫白血病病毒和其它的病毒通过常规试验来 调整。用于被动免疫的抗体优选是单克隆抗体。其特别是用作联合治疗的组分。
[0092] 对于本领域技术人员而言，所有上述的以及其它的成分均是常用的，并能够在常 规试验中获得根据本发明教导的特殊实施方案。
[0093] 在本发明范围内首次提供了超小的二氧化硅一抗原一缀合物，其在免疫后提高有 效的细胞免疫应答。该缀合物以如下方式描述双重作用机制：用于能够特异性靶向抗原呈 递细胞和同时活化补体。与现有技术大的纳米颗粒相比，小于50nm的纳米颗粒具有数倍高 的靶向效率。由于有效地运输到淋巴管中，可以如下有利地利用组织间液的生物物理学机 制：将树突状细胞导向到淋巴结。以这种新型运输途径的纳米颗粒的对流使被动靶向成为 可能，由于树突状细胞在淋巴结中大量存在使特别多的细胞被抵达，因此昂贵的细胞特异 性靶向成为多余。这些性质形成可靠地识别淋巴结树突状细胞的基础一其中包括交叉反应 性（包括靶向外周树突状细胞）的缺失一并形成可重复的、可靠的和完全的吞噬作用进入 这种抗原呈递细胞的基础。在靶向目标上，基于二氧化硅的纳米颗粒承担了第二个有利的 性质，其固有的佐剂效应活化了免疫系统和特别是补体系统。当活化强度独立于所选抗原 时，它可通过粒径而改变。为了活化免疫系统或补体系统无需额外的辅料和/或纳米颗粒 表面改性（如聚羟基化）是明显简单化和成本节约的。
[0094] 根据本发明的纳米颗粒以无机、惰性和生物相容性材料为特征，该材料特别可用 于预防或治疗性免疫。为了改善细胞毒性活性物质的治疗指数，在此由二氧化硅-抗原-缀 合物开发设想的纳米颗粒同样是大有希望的策略。特别地，组分的不稳定连接确保抗原性 治疗剂在身体的特定腔室释放，使得可期望降低可能的副作用。纳米颗粒还以高药学稳定 性为特征，并且不仅仅是由于其较小的粒径而能良好操作。该具有单分散体粒径的超小型 纳米分散体有利地适于可无菌过滤性。
[0095] 可理解，本发明不限于特定的方法、颗粒和条件，如其在此所述的那样，因为这些 事物可以变化。此外还可理解，目前所用的术语仅用于特殊实施方式的描述目的，不应限制 本发明的保护范围。如目前在包括从属权利要求的说明中所使用的一样，单数形式，如"一 个"或"这个"的词形包括相应的复数形式，只要文中没有给出明确的其它说明。例如，"一 个抗原"包括单个抗原或多个抗原，反之，其可以是相同或不同的，或"一种方法"包括相当 的步骤和方法，其对本领域技术人员是已知的。
[0096] 接下来，参照【具体实施方式】的非限制性实施例更详细地阐明本发明。该实施例特 别地如下解释：其不限于具体详细阐明的特征组合，而是反之可以自由组合示例性的特征， 只要能解决发明的问题。
[0097] 实施例1 :单分散的二氧化硅颗粒的制备
[0098] 进行单分散的二氧化硅颗粒的制备--如在EP 0 216 278 Bl所述的--通过在 水-醇-氨介质中水解四烷氧基硅烷，其中首先产生初级粒子溶胶，随后，通过连续地、按照 终止反应措施地控制地计量加入四烷氧基硅烷，使所获得的SiO2颗粒成为所期望的粒径。 为了制备粒径为25nm的50g SiO2颗粒，例如需要1.2L作为增溶剂的乙醇、860ml去离子水、 167ml正硅酸四乙酯（TEOS)和28. 5ml 25%的水性氨溶液。
[0099] 借助于动态光散射检测用 Zetas izer Nano ZS (Malvern Instruments, Herrenbe rg, Deutschland)确定球状二氧化娃颗粒。Malvern-PDI (多分散性指数）的值<0· 1显示 单分散的分布。通过REM摄像在图1中描述了粒径和颗粒形态。
[0100] 实施例2 :具有N端链炔基团的OVA肽片段SIINFEKL的制备
[0101] 在Rink-酰胺树脂上通过Fmoc化学合成所述肽。使用具有合适的侧链保护基团的 N-α-Fmoc-保护的氨基酸。N-甲基-吡咯烷酮用作溶剂。首先在自动合成装置（Applied Biosystems Modell ABI 433 A)上制备肽链。在序列合成结束后脱除末端Fmoc保护基团。 在注射器中手工操作使该聚合物与链炔基羧酸偶联。小心地用DMF，之后二氯甲烷和甲醇 清洗，并将树脂在真空中干燥过夜。为了分离和去除保护，将树脂与5ml的TFA/H20/苯酚/ 三异丙基硅烷（37:1:1:1)混合物掺混，并在室温下振荡2小时。将TFA溶液转移到离心玻 璃杯中，并在4°C下通过二乙醚的缓慢添加沉淀，离心，通过两次添加二乙醚洗涤，干燥，并 溶于2ml H2O/乙腈（I: lv/v)中。通过具有RP-选择B柱（150x IOmm)的RP-HPLC在7. 5 分钟内以0 % B-100 % B的梯度进行纯化（A = H2O和B =乙腈，两