基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米材料、其制备方法及其应用与流程

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种基于二氧化硅的荧光纳米材料、其制备方法及其在活体荧光成像中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤的死亡率逐年攀升，是严重威胁人类健康的重大疾病之一。调查显示中国每年大约有200万的新发病例，130万人死于恶性肿瘤，是目前中国人的第二大主要死因。目前癌症的治疗方法有多种，包括手术切除、化疗及放射治疗等等。其中手术切除主要是依靠医生多年的临床实践经验，但是经验对于癌症边界的判断存在很大的误差和局限性。因此如何精准的定位癌症边界是手术成功的关键，而且微小病灶的发现也有利于癌症的有效消除，减少复发的可能性。

光学成像诊断优点突出，它对人体无损、无创、无电离辐射、设备体积小，便于携带，且成像迅速，灵敏度较高。为了提高荧光成像的分辨率和对比度，一种诊断辅助试剂——荧光染料被引入。传统的荧光染料主要是小分子，其在体内成非特异性分布，仅能对血管或某些特定器官进行成像，限制了其在疾病诊断中的应用。随着纳米技术及荧光成像设备的发展，近年来，光学成像中的激发荧光成像在肿瘤边界以及术中导航领域获得了越来越广泛的应用。然而目前激发荧光在术中导航中的应用大都限于浅表肿瘤如乳腺癌，其在一些内部肿瘤的应用报道极少。这主要是由于激发荧光成像背景噪声大，成像灵敏度低等原因造成的，从而使得癌症的诊断及治疗不够精准。为了改善这一现状。研究人员对荧光染料进行修饰，其主要采取的技术就是物理包埋以及化学键连到纳米粒子上，虽然在一定程度上增加了荧光染料在肿瘤部位的富集，然而众所周知多数荧光染料在聚集状态下其荧光会发生一定程度的淬灭，所以上述方法并不能有效提高肿瘤部位的荧光强度。因此如何提高肿瘤部位的荧光强度，降低背景噪声是目前荧光成像技术中亟待解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的主要目的是为了解决现有荧光染料存在的稳定性差以及体内非特异性分布的缺点，而提供了基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米材料的制备方法及应用。

为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米材料，所述荧光纳米材料的粒径在30-200nm范围之间；以及

所述荧光纳米材料的内核为二氧化硅纳米粒子，所述二氧化硅纳米粒子的表面通过对pH敏感的化学键与荧光染料连接。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将乙醇、氨水、去离子水混合，在30℃条件下搅拌0.5～1h；

步骤2，迅速加入硅烷试剂，继续剧烈机械搅拌15min～24h，反应结束后离心洗涤，将固体产物分散在乙醇中，由此得到二氧化硅纳米粒子；

步骤3，将荧光染料分散在二甲基亚砜中，滴加到步骤2制备得到的二氧化硅纳米粒子中，根据需要加入不同的催化剂进行反应0-24h，分离纯化得最终产物。

作为优选，该制备方法还包括：

步骤4，将步骤3的最终产物分散到去离子水或pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中，通过EDC/NHS反应将靶分子连接到所述最终产物的表面。

作为本发明的再一个方面，本发明还提供了一种如上所述的基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米材料在活体荧光成像中的应用。

基于上述技术方案可知，本发明的方法和由此制备的荧光纳米材料具有如下有益效果：本发明所涉及的原料廉价，反应条件温和，具有较强的可操作性以及可控性；制备的荧光纳米材料粒径均匀可控，具有很好的稳定性，其在循环过程中不产生荧光或者仅发出十分微弱的荧光，而在弱酸性环境中发出强烈荧光，从而起到对比增强的效果，这主要是由于在中性pH条件下染料分子连接在纳米粒子表面处于聚集状态荧光发生淬灭，而在弱酸性环境中染料与纳米粒子间化学键发生断裂，染料游离出来，从而显示出强烈的荧光，因此其在病变组织荧光成像以及与其他成像模式或治疗模式相结合的领域具有较好的应用前景；本发明工艺简单，生成效率高，易于实现大规模生产且具有很好的临床应用潜力。

附图说明

图1为本发明的制备方法示意图；

图2为本发明以带氨基的Cy7荧光染料为例的纳米粒子的扫描电镜图；

图3为本发明以带氨基的Cy7荧光染料为例的纳米粒子的荧光发射光谱图；

图4为本发明以带氨基的Cy7荧光染料为例的纳米粒子的粒径分布图。

具体实施方式

为了更清楚的说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应当以此限制本发明的保护范围。

本发明为了解决现有荧光染料存在的稳定性差以及体内非特异性分布的缺点，而提供了一种基于二氧化硅的荧光纳米材料、其制备方法及其应用。本发明是通过化学反应在二氧化硅纳米粒子的表面通过pH敏感的化学键将荧光染料连接到其表面制备得到基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米材料并将其应用于生物医学领域。本发明的二氧化硅纳米粒子可以通过改变原料成分，使得其表面带有一些易于修饰的活性基团，比如氨基、羟基、羧基等等；制备得到的二氧化硅纳米粒子具有稳定性好、粒径均一可控、低毒，且活体荧光显像对比度高等优点，在病变组织荧光成像领域具有很好的临床应用价值。

更具体地，本发明公开了一种基于二氧化硅的荧光纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将乙醇、氨水、去离子水按照一定比例混合于容器，例如烧瓶中，在30℃下搅拌0.5～1h；

步骤2：迅速加入一定体积的硅烷试剂，继续剧烈搅拌15min～24h，反应结束后离心洗涤，例如在10000rpm下离心，用乙醇洗涤三次，最后超声分散在乙醇中；

步骤3：将荧光染料分散在二甲基亚砜(DMSO)中，滴加到制备得到的二氧化硅纳米粒子中，根据需要加入不同的催化剂进行反应0-24h，最终通过离心或透析或超滤的方法除去游离的染料，并将粒子分散到去离子水或pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中；

步骤4：通过EDC/NHS反应将靶分子连接到纳米粒子的表面，即得到所需的基于二氧化硅的荧光纳米材料。

其中，靶分子包括小分子以及抗体类靶分子。

上述反应中，可以通过改变乙醇、氨水、去离子水以及硅烷试剂的比例以及反应时间来调节纳米材料的粒径。

上述反应中，荧光染料选自荧光素类、罗丹明类、花青素类、碳菁类荧光染料中的一种或多种，例如带氨基的Cy7荧光染料等。

上述反应中，对pH敏感的化学键可以选自亚胺键、马来酸二甲酯键、腙键、肟键、酰腙键、缩醛/缩酮键、原酸酯键中的一种或多种。可以通过精细有机合成路线设计方法在二氧化硅纳米粒子与荧光染料之间形成上述化学键，对于上述带氨基的Cy7荧光染料例如通过添加酸、碱进行反应得到上述化学键。

上述反应中，反应条件温和，连接靶分子之后能够增加纳米粒子的靶向性，增加其在靶组织的富集，增加靶组织与正常组织之间的对比度。

上述反应中，通过改变荧光分子在二氧化硅表面的密度，使得染料发生荧光淬灭，当且仅当纳米材料达到靶组并进入细胞溶酶体或内涵体之后pH敏感的化学键发生断裂才会发出强烈的荧光。

本发明还公开了一种通过上述制备方法制备得到的基于二氧化硅的荧光纳米材料。

本发明还公开了一种基于二氧化硅的荧光纳米材料在制备活体荧光成像显影剂中的应用，从而对病灶组织进行诊断。

下面结合具体优选实施例对本发明的技术方案和效果做进一步的说明。需要说明的是，以下的具体实施方式只是举例说明，本发明的技术方案并不限于以下所列举的具体实施方式，还可以是各种实施方式之间的任意组合。

此外，为了描述的清楚，将实施例1-36的差异对比放于表1中，实施例37-108如后所述只是步骤(5)中的不同，为了节约篇幅未在表1中展现。

实施例1

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水与110mL去离子水在圆底烧瓶中混合，在30℃条件下搅拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(两者的体积比为9∶1～0∶10)迅速加入到步骤(1)中的混合溶液中，继续强烈地机械搅拌15min，反应结束后离心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去离子水分别洗涤2-3次；

(3)将得到的表面带有氨基的二氧化硅纳米粒子分散在pH为8.0的磷酸盐缓冲液，含氨基的荧光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基摩尔比10∶1～2∶1的比例将溶液混合，室温避光磁力搅拌0.5h；

(4)50μL0.25％戊二醛溶液滴加到步骤(3)中的混合溶液中，继续搅拌反应12h；

(5)最后将反应溶液10000rpm离心10min，并用去离子水洗涤三次。

实施例2：

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水与110mL去离子水在圆底烧瓶中混合，在30℃条件下搅拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(两者的体积比为9∶1～0∶10)迅速加入到步骤(1)中的混合溶液中，继续强烈地机械搅拌15min，反应结束后离心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去离子水分别洗涤2-3次；

(3)将得到的表面带有氨基的二氧化硅纳米粒子分散在pH8.0的磷酸盐缓冲液，含醛基的荧光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基∶醛基摩尔比10∶1～2∶1的比例将溶液混合，室温避光磁力搅拌反应24h；

(4)最后将反应溶液10 000rpm离心10min，并用去离子水洗涤三次。

实施例3：

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水与110mL去离子水在圆底烧瓶中混合，在30℃条件下搅拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(两者的体积比为9∶1～0∶10)迅速加入到步骤(1)中的混合溶液中，继续强烈地机械搅拌15min，反应结束后离心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去离子水分别洗涤2-3次；

(3)将得到的表面带有氨基的二氧化硅纳米粒子分散在pH为8.0的磷酸盐缓冲液，含羰基的荧光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基摩尔比10∶1～2∶1的比例将溶液混合，磁力搅拌室温混合0.5h；

(4)4倍羰基当量的DCC加入到上去混合溶液中，继续避光搅拌反应24h；

(5)最后将反应溶液10 000rpm离心10min，并用去离子水洗涤三次。

实施例4-6：

同具体实施方式1-3，不同之处仅在于，步骤(2)中加入的正硅酸乙酯部分替换为聚乙二醇修饰的硅烷试剂，结果相似。

实施例7-36：

同实施例1-6不同之处仅在于，在步骤(2)中将氨基丙基三乙氧基硅烷替换为氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基甲基三甲基硅烷、3-氨基丙基二(三甲基硅氧基)甲基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三(甲氧基乙氧基乙氧基)硅烷中的一种或几种代替，结果相似。

实施例37-108：

同实施例1-36不同之处仅在于，在步骤(5)之后，按照氨基：NHS活化的抗体(实施例37-72)或小分子类靶分子(实施例73-108)摩尔比1∶1～100∶1的比例加入活化的靶分子，得到靶向性的基于二氧化硅的pH敏感的荧光纳米粒子。

表1

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。