本发明涉及的是一种生物纳米材料领域的技术，具体是一种在稀土上转换纳米材料表面修饰蛋白质的方法。
背景技术：
上转换纳米材料(Upconversion Nanoparticles，简称UCN)，如Yb、Tm、Ho或其他稀土元素掺杂的NaLnF4纳米颗粒(Ln为镧系元素)，是一类吸收长波长(红外光)、低能量光子，发射短波长(可见光)、高能量光子的新型荧光纳米材料。与传统的下转换纳米材料如量子点，纳米金等对比，UCN具有许多独特的优点，如优异的光学稳定性、高化学稳定性、低毒性，另外在近红外光激发下具有组织穿透能力深、对生物组织无损伤、近乎零背景荧光干扰、成像灵敏度高等诸多优点，在生物医学中有着广泛的应用前景，如生物标记、细胞成像、病变检测、DNA检测、生物传感等。
然而，通过现有方法获得的纯UCN表面没有可以利用的基团，使生物活性分子无法直接固定于UCN表面，限制了生物相容性、毒性等生物化学性质的改善，并限制其在生物医学领域的应用。因此对UCN的表面进行蛋白质修饰是其在生物医用领域应用的重要需求之一。
现有凭借表面静电吸附生物活性分子的方法，也有对UCN表面通过SiO2层包裹后再通过硅烷偶联剂的偶联作用进行修饰的方法。这些方法或稳定性、重现性不高，或过程繁琐、效率不高。
技术实现要素：
本发明针对现有技术连接过程复杂、修饰效率较低等缺陷，提出一种上转换纳米材料的表面修饰方法，能简便、高效地在上转换纳米材料表面通过直接硅烷化的方式进一步耦联蛋白质生物活性分子。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种上转换纳米材料的表面直接硅烷化方法，通过向分散于溶剂中的UCN滴加硅烷偶联剂并充分反应后得到表面包覆SiO2壳及修饰有氨基的UCN。
所述的上转换纳米材料UCN包括但不限于：NaYF4、NaLnF4等掺杂稀土元素的上转换纳米材料。
所述的溶剂，采用但不限于环己烷。
所述的溶剂中优选加有表面活性剂且pH值为8～9。
所述的表面活性剂采用壬基酚聚醚类表面活性剂，优选采用CO-520，通过氨水调节碱性环境。
所述的硅烷偶联剂采用三烷氧基型硅烷偶联剂，优选采用APTS，制备得到修饰有氨基的SiO2壳层，不仅可以有效改善UCN的生物相容性等化学性质，而且为进一步的表面修饰耦联蛋白质分子做了基础。
所述的表面包覆SiO2壳及修饰有氨基的UCN，具体通过以下方式制备：
1)称量UCN粉末分散于10～1000mL环己烷中，相应的质量与体积比为1:1，超声8～12min分散均匀；
2)加入壬基酚聚醚类表面活性剂，超声8～12min后室温磁力搅拌1～1.5h；
3)加入氨水，调节溶液体系的pH值为8～9后室温磁力搅拌20～40min；
4)缓慢滴加三烷氧基型硅烷偶联剂于反应溶液体系中，搅拌36～52h；
5)取出反应产物，采用离心方法(9000r/min，6min)，加入无水乙醇(乙醇与产物溶液体积比至少大于1:1)沉淀并用超纯水清洗3～4遍，收集沉淀物真空冷冻干燥16～32h即可得到表面包覆SiO2壳及修饰有氨基的上转换纳米材料。
本发明涉及一种UCN表面修饰蛋白质生物活性分子的方法，将上述表面包覆SiO2壳及修饰有氨基的UCN分散于溶剂中得到纳米粒子分散液，并将蛋白质生物活性分子分散于缓冲液中得到蛋白质溶液，然后将纳米粒子分散液与蛋白质溶液混合后加入NHS和EDC作为催化剂并充分反应得到表面修饰蛋白质的上转换纳米材料。
所述的纳米粒子分散液与蛋白质溶液的溶质质量比优选为1:2。
所述的溶剂，优选采用去离子水。
所述的缓冲液，优选采用PBS缓冲液。
所述的蛋白质生物活性分子，包括但不限于：HER-2抗体、血清蛋白、酶等蛋白质分子等。
所述的表面修饰蛋白质的上转换纳米材料，具体通过以下方法制备得到：
a)称量上述表面包覆SiO2壳及修饰有氨基的UCN和蛋白质，将UCN分散于1～1000mL超纯水中配制UCN分散溶液，将蛋白质生物活性分子溶于4～1000mL的浓度为10mM的PBS缓冲溶液(pH7.4)中。
b)按照溶质质量比为1:2的比例量取上述纳米粒子分散液和蛋白质溶液并混合，然后加入足量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液作为催化剂；将混合溶液体系室温搅拌3～5小时；
c)取出反应物，采用离心方法(9000r/min，6min)，加入超纯水清洗3～4次，收集沉淀物分散于超纯水中或真空冷冻干燥后冷藏保存，即得到表面修饰蛋白质的上转换纳米材料。
本发明涉及一种通过上述方法制备得到的表面修饰有蛋白质生物活性分子的UCN的应用，将其作为特异性靶向标记物，应用于生物医学影像、重大疾病治疗或体外生物检测中。
技术效果
与现有技术相比，本发明的技术效果包括：
1.室温即可进行，制备方法过程优化简便，生产周期短；
2.重复性、稳定性高；
3.表面耦联蛋白质分子的适用范围广泛，如抗体、血清蛋白、酶等蛋白质分子类型，可针对需求选择特异性蛋白质分子进行表面修饰，拓展了本发明在生物医学领域的应用范围等。
具体实施方式
实施例1
本实施例包括以下步骤：
1)称取1000mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上转换纳米颗粒，分散于1000mL环己烷中，超声处理8～12min使其分散均匀。
2)加入50mL的CO-520，超声处理8～12min，室温磁力搅拌1.5h。加入10mL氨水调节混合体系pH为8.5-9，室温磁力搅拌30min。
3)逐滴加入4mLAPTS(边搅拌边滴加)，室温磁力搅拌48h。取出反应后混合液采用离心方法(9000r/min，6min)，加入无水乙醇产生沉淀，并用超纯水清洗3次。真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为包覆连有氨基的SiO2壳的上转换纳米材料。
4)称取UCN@SiO2-NH2 5mg，分散于1mL超纯水中，超声均匀。
5)称取10mgHER2抗体，溶于4mLPBS缓冲溶液(pH7.4)中。
6)将两溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3mL，室温磁力搅拌4h。
7)取出反应后溶液，采用离心方法(9000r/min，6min)，加入超纯水清洗3次，真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为表面修饰HER2抗体的上转换纳米材料。
实施例2
本实施例包括以下步骤：
1)称取100mgNaYF4：Er，Ho@NaGdF4上转换纳米颗粒，分散于100mL环己烷中，超声处理8～12min使其分散均匀。
2)加入5mL的CO-520，超声处理8～12min，室温磁力搅拌1.5h。
3)加入1mL氨水调节混合体系pH为8.5-9，室温磁力搅拌30min。
4)逐滴加入400μLAPTS(边搅拌边滴加)，室温磁力搅拌48h。取出反应后混合液采用离心方法(9000r/min，6min)，加入无水乙醇产生沉淀，并用超纯水清洗3次。真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为包覆连有氨基的SiO2壳的上转换纳米材料。
5)称取UCN@SiO2-NH2 30mg，分散于6mL超纯水中，超声均匀。
6)称取60mgHER2抗体，溶于24mLPBS缓冲溶液(pH7.4)中。
7)将两溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各18mL，室温磁力搅拌4h。取出反应后溶液，采用离心方法(9000r/min，6min)，加入超纯水清洗3次，真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为表面修饰HER2抗体的上转换纳米材料。
实施例3
本实施例包括以下步骤：
1)称取10mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上转换纳米颗粒，分散于10mL环己烷中，超声处理8～12min使其分散均匀。
2)加入500μL的CO-520，超声处理8～12min，室温磁力搅拌1.5h。
3)加入100μL氨水调节混合体系pH为8.5-9，室温磁力搅拌30min。逐滴加入40μLAPTS(边搅拌边滴加)，室温磁力搅拌48h。
4)取出反应后混合液采用离心方法(9000r/min，6min)，加入无水乙醇产生沉淀，并用超纯水清洗3次。真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为包覆连有氨基的SiO2壳的上转换纳米材料。
5)称取UCN@SiO2-NH2 5mg，分散于1mL超纯水中，超声均匀。
6)称取10mg牛血清蛋白，溶于4mLPBS缓冲溶液(pH7.4)中。
7)将两溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3mL，室温磁力搅拌4h。取出反应后溶液，采用离心方法(9000r/min，6min)，加入超纯水清洗3次，真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为表面修饰HER2抗体的上转换纳米材料。
实施例4
本实施例包括以下步骤：
1)称取100mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上转换纳米颗粒，分散于100mL环己烷中，超声处理8～12min使其分散均匀。
2)加入5mL的CO-520，超声处理8～12min，室温磁力搅拌1.5h。
3)加入1mL氨水调节混合体系pH为8.5-9，室温磁力搅拌30min。
4)逐滴加入400μLAPTS(边搅拌边滴加)，室温磁力搅拌48h。取出反应后混合液采用离心方法(9000r/min，6min)，加入无水乙醇产生沉淀，并用超纯水清洗3次。真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为包覆连有氨基的SiO2壳的上转换纳米材料。
5)称取UCN@SiO2-NH2 50mg，分散于100mL超纯水中，超声均匀。
6)称取100mgHER2抗体，溶于400mLPBS缓冲溶液(pH7.4)中。
7)将两溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各300mL，室温磁力搅拌4h。取出反应后溶液，采用离心方法(9000r/min，6min)，加入超纯水清洗3次，真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为表面修饰HER2抗体的上转换纳米材料。
实施例5
本实施例包括以下步骤：
1)称取100mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上转换纳米颗粒，分散于100mL环己烷中，超声处理8～12min使其分散均匀。
2)加入5mL的CO-520，超声处理8～12min，室温磁力搅拌1.5h。
3)加入1mL氨水调节混合体系pH为8.5-9，室温磁力搅拌30min。逐滴加入400μLAPTS(边搅拌边滴加)，室温磁力搅拌48h。
4)取出反应后混合液采用离心方法(9000r/min，6min)，加入无水乙醇产生沉淀，并用超纯水清洗3次。真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为包覆连有氨基的SiO2壳的上转换纳米材料。
5)称取UCN@SiO2-NH2 50mg，分散于1000mL超纯水中，超声均匀。
6)称取100mgHER2抗体，溶于4000mLPBS缓冲溶液(pH7.4)中。将两溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3000mL，室温磁力搅拌4h。
7)取出反应后溶液，采用离心方法(9000r/min，6min)，加入超纯水清洗3次，真空冷冻干燥24h，得到白色粉末，即为表面修饰HER2抗体的上转换纳米材料。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。