具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域中的单壁碳纳米管及其制备方法，具体涉及一种可示踪的携带近红外荧光染料Cy5.5的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针、其制备方法以及作为精准治疗工具的应用。

背景技术：

光热疗法是利用近红外808nm的激光照射纳米材料聚集的病灶区域，产生局部高温杀伤病灶，同时减少对正常组织损伤的一种辅助治疗方法。

单壁碳纳米管由于其结构的特殊性在生物医药领域中有非常广泛的应用前景。单壁碳纳米管光稳定性好，在近红外区有很强的光吸收，可以将吸收的光能转化为热能，与传统的放疗、化疗相比更加安全有效。但未经功能化的单壁碳纳米管容易团聚，而且毒性比较大，几乎不溶于水以及有机溶剂，生物相容性很差。为使单壁碳纳米管有比较好的水溶性，并减少毒性，当前的研究主要是在单壁碳纳米管进入生物体之前进行表面修饰，例如对其表面包裹PEG可以减少探针被巨噬细胞吞噬，从而增加血液循环时间，有利于更大程度的使探针进入目标区域。在生物成像方面，此分子探针在合适的粒径范围内可以通过EPR效应或者主动靶向在目标区域中富集，在710nm激光激发后成像，并在808nm照射下将光能转换为热能，产生局部高温以达到光热治疗的效果。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种新的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针。

本发明的另一目的在于提供所述具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的应用。

一方面，本发明提供了一种新的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针，具体而言，本发明提供的单壁碳纳米管近红外探针，是加载有荧光染料Cy5.5的单壁碳纳米管。

Cy5.5是一种水溶性的荧光染料，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。Cy5.5的激发波段在678-710nm，是荧光强度高且光稳定性强的长波长染料。其在体内的清除经肝脏排入胆道，最后进入肠道排出体外。当Cy5.5受到波长为678-680nm的波长激发以后，会释放出波长大约为695-710nm的红外光。在生物体内，近红外光可以穿透深层组织且被检测到，因此可以利用近红外成像确定病灶的位置以及范围，达到辅助光热治疗的效果。

本发明中，通过在单壁碳纳米管上加载荧光染料Cy5.5，使得SWNT在近红外808nm区域的吸光度增强。结合小动物活体成像系统(IVIS)进行近红外成像，定位病灶组织的同时选择最佳时间点进行光热治疗，达到最佳治疗效果。

根据本发明的具体实施方案，本发明的单壁碳纳米管近红外探针，其是先对单壁碳纳米管进行羧基化并进行DSPE-PEG表面修饰、之后再加载有荧光染料Cy5.5而制备得到的。

另一方面，本发明提供了一种具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的制备方法，该方法包括步骤：

对单壁碳纳米管进行羧基化，制备羧基化单壁碳纳米管；

对羧基化单壁碳纳米管进行DSPE-PEG表面修饰，得到DSPE-PEG表面修饰的单壁碳纳米管；

在DSPE-PEG表面修饰的单壁碳纳米管上加载荧光染料Cy5.5，制备得到本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针。

本发明的制备方法中，通过将未功能化的单壁碳纳米管(SWNT)进行羧基化，加载DSPE-PEG，从而屏蔽SWNT的免疫原性，且能保护其生物活性，延长探针在体内的半衰期。之后耦合近红外荧光染料Cy5.5得到被动靶向探针(SWNT-Cy5.5)。

根据本发明的具体实施方案，本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的制备方法中，对单壁碳纳米管进行羧基化的过程包括：

先在单壁碳纳米管中加入3:1的硝酸与浓硫酸混合液体并进行超声，使硝酸分子与单壁碳纳米管充分接触；在磁力搅拌条件下进行回流操作；然后分离硝酸分子，得到羧化的单壁碳纳米管。

更具体地，上述对单壁碳纳米管进行羧基化的过程中，在单壁碳纳米管中加入的3:1的硝酸与浓硫酸混合液体的量与单壁碳纳米管的比例为50～150ml：1g。之后进行的超声主要是使硝酸分子与单壁碳纳米管充分接触，通常的超声条件为80～200W超声20分钟～2小时。

更具体地，上述对单壁碳纳米管进行羧基化的过程中，回流操作可以在105～115℃油浴中充分磁力搅拌条件下进行8～12小时。

更具体地，上述对单壁碳纳米管进行羧基化的过程中，分离硝酸分子的操作可包括：静置回流操作后的混合液，除去上清液再加水搅拌然后静置，除去上清液，可重复多次至游离的硝酸分子被分离出去。另外，优选地，也可再加水，辅以超声等，使吸附在单壁碳纳米管上的残余硝酸溶解在水中被分离出去。分离除去硝酸分子后的沉淀物即为羧基化单壁碳纳米管。具体实施时，可对分离除去硝酸分子后的沉淀物(残留有部分液体)进行抽滤并干燥，得到粉末状的羧化单壁碳纳米管，便于保存称重。

根据本发明的具体实施方案，本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的制备方法中，对羧基化单壁碳纳米管进行DSPE-PEG表面修饰的过程包括：取羧化后的单壁碳纳米管溶于去离子水，加入DSPE-PEG并充分结合，以修饰单壁碳纳米管表面。根据本发明的具体实施方案，本发明所用DSPE-PEG可为各种商购产品，例如可以是DSPE-PEG2000，或是DSPE-PEG WM3500等，符合相关行业标准要求即可。根据本发明的优选具体实施方案，本发明加入的DSPE-PEG的量为其与羧基化单壁碳纳米管的质量比为不低于0.5：1，更优选为0.5～2：1。本发明中，对反应体系中的水量无特定要求，便于操作即可，通常可以是1mg羧化后的单壁碳纳米管溶于50～200mL去离子水中。本发明中，加入DSPE-PEG后可在70～150rpm转速下摇床震荡0.5-2小时以使DSPE-PEG与单壁碳纳米管充分结合修饰在单壁碳纳米管表面。

根据本发明的具体实施方案，本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的制备方法中，在DSPE-PEG表面修饰的单壁碳纳米管上加载荧光染料Cy5.5的过程可包括：向DSPE-PEG表面修饰的单壁碳纳米管溶液中加入Cy5.5，37℃±2℃摇床过夜，即得到加载有荧光染料Cy5.5的单壁碳纳米管(溶液形式)。本发明中将该加载有荧光染料Cy5.5的单壁碳纳米管命名为SWNT-Cy5.5，即为本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针。

根据本发明的具体实施方案，上述在DSPE-PEG表面修饰的单壁碳纳米管上加载荧光染料Cy5.5的过程中，向DSPE-PEG表面修饰的单壁碳纳米管溶液中加入的Cy5.5的量与羧基化单壁碳纳米管的质量比不低于0.01：1，优选为0.01～0.5：1。

根据本发明的具体实施方案，上述在DSPE-PEG表面修饰的单壁碳纳米管上加载荧光染料Cy5.5的过程中，摇床过夜通常是指70～120rpm条件下摇床震荡8～14小时。摇床过夜后的溶液中即包含本发明的加载有荧光染料Cy5.5的单壁碳纳米管探针。更进一步，摇床过夜后的溶液可进一步离心(例如500～2000rpm离心10～30min)，弃掉上清液，余沉淀冻干或加去离子水配制成所需要的各浓度，避光4℃以下保存。

另一方面，本发明还提供了所述的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的应用。

具体而言，本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针加载有Cy5.5，在675nm激光照射下，能对病灶区域进行近红外荧光成像。因此，本发明的单壁碳纳米管近红外探针可用于制备用于病灶区域近红外成像的制剂。

本发明中，通过检测发现，探针粒径小，在50-120nm之间，单分散性与稳定性好，荧光性能稳定，毒性小。

此外，本发明的探针可引导病灶区域近红外成像，从而协助准确诊断以及治疗。将探针应用于临床辅助治疗的光学成像，可以提高术后残余的检出率，并通过光热效应进行局部高温，减小或消除病灶，提高患者术后生存率和生活质量。

综上所述，本发明的技术方案具有如下有益效果：

1、本发明所涉及的合成方法简单易操作，且单壁碳纳米管本身的比表面积大，易修饰等优点；

2、本发明所合成的SWNT-Cy5.5具有稳定的发光效率，且在近红外区域的吸光度增强；

3、本发明所合成的纳米探针粒径小，在50-120nm之间，利于通过EPR效应进入病灶组织；

4、本发明所合成的SWNT-Cy5.5具有重要的应用价值，尤其在光热治疗方面，结合活体成像系统，可以辅助术者精准定位病灶位置，利用808nm激光照射使之产生局部高温，有效杀死细胞，提高术后的生存率和生活质量，具有良好的应用前景和经济价值。

附图说明

图1为本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外成像探针的制备方法的流程示意图。

图2为实施例1制备的近红外探针SWNT-Cy5.5的荧光信号检测图。

图3为实施例1制备的近红外探针SWNT-Cy5.5的体外光热效果评估图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未详细说明的操作过程，可参照所属领域中的常规操作或是按照仪器设备说明书进行；未详细注明的温度压力条件，是在室温和常压条件下进行。

实施例1

请参见图1所示，本发明的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的制备方法主要包括步骤：

步骤S1：羧基化单壁碳纳米管。更具体的步骤包括：

在单壁碳纳米管中加入硝酸与浓硫酸混合液体并进行超声的步骤S101；在单壁碳纳米管中加入硝酸与浓硫酸混合液体并进行超声，可使得硝酸分子与单壁碳纳米管充分接触；

回流操作并分离硝酸分子的步骤S102；该过程主要是进行回流操作，并除去游离或残余的硝酸分子，得到羧化后单壁碳纳米管。

步骤S2：对单壁碳纳米管进行表面修饰。本实施例中，是采用DSPE-PEG对单壁碳纳米管进行表面修饰。

步骤S3：加载荧光染料Cy5.5，制备具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针。

本实施例的具有光热效应的单壁碳纳米管近红外探针的制备方法主要操作如下：

1.V/V＝3:1的硝酸和浓硫酸共40ml中加入0.5g单壁碳纳米管与100ml的烧瓶中；

2.在回流前先100W超声30min，主要目的是让硝酸分子与单壁碳纳米管充分接触；

3.在回流装置中，110℃油浴并磁力搅拌10小时；

4.静置1小时，用移液器移去上面的硝酸，再加水搅拌几分钟然后静置，除去清液，这样重复3次；

5.再加水，超声15min，然后磁力搅拌过夜，超声的目的是为了让吸附在单壁碳纳米管上的残余硝酸与溶解在水中，最后进行抽滤，用水和乙醇冲洗；

6.抽滤后干燥，得到的粉末碾磨，即为羧化后的单壁碳纳米管；

7.称取0.5mg羧化后的单壁碳纳米管溶于50mL去离子水，超声后加入0.5mgPEG，80rpm摇床0.5-1小时使DSPE-PEG充分结合修饰单壁碳纳米管表面，之后，加入0.02mg的Cy5.5，37℃80rpm摇床过夜，以1000r/min的转速离心15min，弃掉上清液，余沉淀即为最终使用的探针，本发明命名为SWNT-Cy5.5，可加去离子水避光4℃以下保存。经检测，本发明的SWNT-Cy5.5探针粒径基本上在60-100nm之间。

实施例2

请参见图2所示，为本实施例1制备的近红外探针SWNT-Cy5.5的荧光信号检测图。

其中，本发明的探针为SWNT与Cy5.5耦合后的探针SWNT-Cy5.5，其在808nm处的吸光度与单独的SWNT、Cy5.5两种物质以及两种物质简单混合(SWNT&Cy5.5)相比明显增强。因此SWNT-Cy5.5在808nm激光照射下能够产生更好的光热效果。

实施例3

请参见图3所示，为本发明实施例1制备的近红外探针SWNT-Cy5.5的体外光热效果图。图3为以不同浓度的探针孵育细胞，再以808nm激光照射杀死细胞的光热效果图，其中以单独的SWNT、Cy5.5两种物质做对照进行平行实验。细胞存活率随着孵育探针浓度的增加而降低，从而说明了SWNT-Cy5.5的光热效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。