一类可修饰的近红外二区荧光成像探针及其制备方法和用途与流程

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一类可修饰的近红外二区荧光探针及其制备方法和在生物医学荧光成像领域的应用。

背景技术：

癌症(又称恶性肿瘤)严重威胁着人类健康。由于医疗技术水平的限制，目前缺乏对晚期癌症的有效治疗手段，所以癌症的早期诊断对患者来说尤为重要，若能尽早发现并及时采取治疗，可以显著提高癌症患者的存活率。非侵入式的活体动物荧光成像技术等分子影像技术的出现为癌症的早期诊断开拓了新的发展道路。

另外，最初的肿瘤转移一般发生在前哨淋巴结。前哨淋巴结是直接接受来自肿瘤的原发病灶淋巴流的淋巴结。在早期肿瘤切除手术中，前哨淋巴结导航手术正被广泛采用，所谓前哨淋巴结导航手术是使用荧光成像探针鉴定前哨淋巴结，随后通过手术切除，并通过体外辅助检查确定癌症是否转移。使用该方法，能够及时阻断癌症转移或者通过切除的淋巴结精确诊断癌症是否转移，进而确定是否需要进行手术后抗肿瘤放化疗，尽最大可能减少患者的负担。

生物组织在<700nm范围内有较强的自身荧光且有严重的光吸收，会严重干扰荧光成像效果。在近红外区(700～1600nm)生物组织光吸收或自身荧光强度都很小，近红外荧光成像技术受到越来越多的关注。近红外荧光分为近红外一区(700～1000nm)和近红外二区(1000～1600nm)。由于近红外二区(1000～1600nm)荧光对生物组织穿透能力比近红外一区更强，且成像信噪比和分辨率都更高(pnas,2011,108,8943-8948)，近红外二区荧光成像更有希望在未来的活体成像、肿瘤早期诊断和手术导航等领域发挥重大作用。

迄今为止，近红外二区荧光成像材料主要为生物相容性差，毒性大或生物体难以吸收、代谢、排泄的成像试剂，主要包括单层碳纳米管(nat.photonics.,2014,8,723-730；angew.chem.int.ed.,2015,54,14758-14762)、高分子聚合物(nat.commun.,2014,5,4206)、量子点(acs.nano.,2012,6,3695-3702；angew.chem.int.ed.,2012,51,9818-9821；biomaterials.,2015,53,265-273)、稀土纳米微粒(nat.commun.,2013,4,2199；j.mater.chem.b.,2016,4,87-95)等。目前只有少数可被生物体通过肾脏排泄的小分子近红外二区荧光成像试剂(nat.mater.,2016,15,235-242；chem.sci.,2016,7,6203-6207)被报道。

为了获得具有优异成药性的近红外二区荧光成像探针，非常需要发展具有高灵敏度、高生物相容性、高发光亮度、光稳定性好、无毒且更易于排泄的小分子近红外二区荧光成像试剂。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一类可修饰的、光稳定性高的、生物相容性好的近红外二区荧光有机小分子探针。具体来讲，本发明涉及一类可以用于癌症诊断、体内血管和淋巴结成像的探针材料，并成功地将材料应用于导航外科手术及术后评价。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一类可修饰的近红外二区荧光化合物，含有苯并噻二唑和芴环，具有通式(1)所述的结构：

其中：

r为：或h，n＝0～18，m＝0～20，m,n为整数；

r1，r2独立地为：nh2，no2，oh，或h，但r1、r2不同时为h，n＝0～18，n为整数；

r3、r4、r5、r6独立地为：或n＝0～18，m＝1～200，m、n为整数；x＝f、cl、br、i或n3。

所述的具有通式(1)所示的结构的荧光化合物，其荧光发射波长为900～1600nm。

一种制备通式(1)所述的荧光探针的方法，反应路线如下：

反应条件为：

(1)取化合物2、化合物3和碳酸钾加入反应容器中，在氮气或氩气保护下加入四氢呋喃-水，其中，四氢呋喃和水的体积比为8～2:1，向反应液中通入氩气或氮气排除体系内氧气，加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，氮气或氩气保护下在70℃～80℃回流反应10～20小时，反应结束后纯化得中间体4。

(2)取化合物4、化合物5和碳酸钾加入反应容器中，在氮气或氩气保护下加入四氢呋喃-水，其中，四氢呋喃和水的体积比为8～2:1，向反应液中通入氩气或氮气排除体系内氧气，加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，氮气或氩气保护下在70℃～80℃回流反应10～20小时，反应结束后纯化得中间体6。

(3)取化合物6、锌粉和氯化铵加入反应容器中，在氮气或氩气保护下加入二氯甲烷-甲醇-水混合溶剂，甲醇的含水量为80～95wt％，二氯甲烷和甲醇-水的体积比为0.5～2:1，反应液在5℃～35℃反应3～6小时。反应结束后过滤、干燥、除去溶剂得中间体。在氮气或氩气保护下将中间体加入无水吡啶中，加入n-亚磺酰苯胺和三甲基氯硅烷，反应混合液在70℃～90℃加热反应15～24小时，反应结束后提纯得化合物1。

步骤(1)和步骤(2)所述的化合物2、化合物3、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物和碳酸钾的摩尔比为1:1:0.05～0.1:1～2.5，以及化合物4、化合物5、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物和碳酸钾的摩尔比为1:1:0.05～0.1:1～2.5。

步骤(3)所述的化合物6、锌粉和氯化铵的摩尔比为1:30～120:10～36，所述的中间体6、n-亚磺酰苯胺和三甲基氯硅烷的摩尔比为1:4～36:4～70。

本发明式(1)化合物可以用作生物体内成像的近红外二区荧光成像探针，特别是应用于癌症诊断中，还可使用在通式(1)所示的化合物可修饰位点修饰上聚乙二醇、多肽、蛋白、核酸适配体、叶酸等的衍生物。此处，癌症主要指脑胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、食道癌、宫颈癌和卵巢癌。

本发明式(1)化合物或式(1)所示的化合物可修饰位点修饰上聚乙二醇、多肽、蛋白、核酸适配体、叶酸等的衍生物可以用于制作全身血管成像和前哨淋巴结手术导航切除术中的纳米粒。将聚乙二醇修饰磷脂溶于水中，在超声下形成空腔球形粒子，滴加式(1)化合物或前述式(1)化合物衍生物的四氢呋喃溶液，超声下使之进入空腔中，氮吹除去四氢呋喃形成稳定的纳米粒。优选纳米粒的粒径为30～300nm，较优选为50～150nm。

本发明所得的如通式(1)所述的化合物或其衍生物为具有可修饰基团的全新化合物，其荧光发射波长位于近红外二区，无毒，生物相容性好，易被生物体吸收和代谢。经不同后修饰或包载后，可用于肿瘤等不同疾病的检测以及血管和淋巴结成像。

本发明的近红外二区荧光成像探针，由市售的化合物2、3和5经两步偶联反应生成主体分子结构，在锌粉和氯化铵作用下还原硝基成氨基，随后在n-亚磺酰苯胺和三甲基氯硅烷共同作用下关环生成第二个苯并噻二唑环得终产物。从实施例中可知该方案合成路线简单，反应效率高，收率高，具有较高的工业应用前景。

本发明的创造性在于在苯并噻二唑母核上引入了芴环，可增加荧光材料的量子产率。芴环上引入可修饰基团，增加的可修饰位点可用于连接不同的生物活性官能团，进而增加荧光探针的应用领域以及改善其水溶性和生物相容性。在生物医学成像实验中发现该荧光探针成像效果非常好，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为近红外二区荧光成像探针1a的合成路线。

图2为近红外二区荧光成像探针1a吸收和荧光发射光谱图。

图3为化合物1a-peg1000修饰物的合成方案。

图4为尾静脉注射化合物1a-peg1000修饰物在进入右后肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠体内近红外二区检测图。

图5为化合物1a-rgd修饰物的合成路线。

图6上侧为尾静脉注射化合物1a-rgd修饰物在进入右后肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠体内近红外二区成像效果，下侧为尾静脉注射化合物1a-rgd修饰物和rgd的混合液在右后肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠体内近红外二区成像效果，图右侧中间位置为亮度标尺。

图7为化合物1a纳米粒的粒径分布。

图8为尾静脉注射化合物1a纳米粒进入右前肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠体内近红外二区肿瘤局部血管和小鼠全身血管成像效果。

图9为通过小鼠前足注射化合物1a纳米粒的正常小鼠前哨淋巴结成像以及化合物1a纳米粒导航外科手术过程及手术前后评价的图像，其中，时间顺序依次为i、ii、iii、iv、v、vi。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明，实施例里涉及的化合物1a,2a,3a,4a,5a等的具体结构见附图中的反应式。

实施例1：化合物4a的制备

取化合物2a(5.48g，10mmol)、化合物3a(4.81g，10mmol)和碳酸钾(3.45g，25mmol)加入500ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入四氢呋喃-水(v/v，5:1)300ml，向反应液中通入氩气鼓泡5min排除体系内氧气，加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(0.9g，1mmol)，氩气保护下在75℃油浴中加热回流反应14小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氢呋喃，残渣复溶在200ml二氯甲烷中，水(50ml×3)洗三次，饱和食盐水(50ml×3)洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥3小时，过滤，滤液旋干得7.4g化合物4a。收率：90％。

化合物4a结构测定数据如下：

hrms(esi)calcdfor:c33h21brn5o10s3⁺([m+h]⁺):821.9634,found:821.9627.

实施例2：化合物5a的制备

取化合物4a(7.4g，9mmol)、化合物3a(4.329g，9mmol)和碳酸钾(3.105g，22.5mmol)加入500ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入四氢呋喃-水(v/v，5:1)270ml，向反应液中通入氩气鼓泡5min排除体系内氧气，加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(0.81g，0.9mmol)，氩气保护下在75℃油浴中加热回流反应20小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氢呋喃，残渣复溶在150ml二氯甲烷中，水(30ml×3)洗三次，饱和食盐水(30ml×3)洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥3小时，过滤，滤液旋干得9.08g化合物5a。收率：92％。

化合物5a结构测定数据如下：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(dd,j＝8.4,1.7hz,2h),8.31(s,2h),7.92(t,j＝7.5hz,4h),7.83(d,j＝8.3hz,2h),7.76(s,2h),7.60(dd,j＝9.9,3.9hz,4h),2.65–2.54(m,8h),1.63(dd,j＝13.8,7.3hz,8h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ174.3,153.6,152.0,151.7,151.0,149.2,148.3,143.1,141.0,136.2,133.8,131.2,128.2,126.6,125.9,123.9,122.5,122.2,122.1,120.2,56.1,36.07,30.7.

hrms(esi)calcdfor:c52h37n6o16s3⁺([m+h]⁺):1097.1428,found:1097.1433.

实施例3：化合物1a的制备

取化合物5a(9.08g，8.28mmol)、锌粉(64.915g，993.6mmol)和氯化铵(15.947g，298.08mmol)加入1000ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入二氯甲烷300ml和甲醇-水(v/v，9:1)300ml混合溶剂，反应液在25℃机械搅拌反应4小时。反应结束后硅藻土过滤除去不溶固体、加300ml二氯甲烷洗，收集滤液用水(100ml×3)洗三次，饱和碳酸氢钠溶液(100ml×3)洗三次，饱和食盐水(100ml×3)洗三次，有机相用无水硫酸镁干燥3小时、过滤，除去溶剂得中间体。在250ml圆底烧瓶中氩气保护下将中间体加入到160ml无水吡啶中，加入n-亚磺酰苯胺(9.09g，66.24mmol)和三甲基氯硅烷(7.13g，66.24mmol)，反应混合液在80℃油浴中加热反应20小时，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入100ml冰水中，二氯甲烷(100ml×3)萃取三次，合并有机相，有机相用水(50ml×3)洗三次，饱和食盐水(60ml×3)洗三次，无水硫酸镁干燥。过滤除去硫酸镁，滤液减压浓缩，固体残渣过硅胶柱提纯得7.23g化合物1a。两步收率87％。

化合物1a结构测定数据如下：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.95(d,j＝2.5hz,2h),7.74(s,2h),7.68(s,2h),7.56(s,2h),7.50(d,j＝8.0hz,4h),6.69(d,j＝7.7hz,4h),2.58–2.45(m,4h),2.45–2.35(m,4h),1.69(dd,j＝10.1,5.3hz,8h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ175.3,152.7,151.6,151.2,149.2,148.4,143.6,138.7,135.6133.4,133.4,127.2,125.5,122.8,121.4,120.7,116.4,111.1,55.1,36.5,30.8.

hrms(esi)calcdfor:c52h41n6o8s4⁺([m+h]⁺):1005.1869,found:1005.1865.

实施例4：化合物1a-peg1000修饰物的制备及其肿瘤成像效果

取化合物1a(2mg，0.002mmol)、甲氧基聚乙二醇氨基(32mg，0.032mmol，m.w.～1000)加入5ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入无水dmf1ml，搅拌使溶解，随后加入hbtu(15mg，0.04mmol)和dipea(20μl)，反应液在25℃搅拌反应24小时。反应结束后加乙醚沉淀，收集固体，固体复溶于去离子水中，通过半制备型高效液相色谱纯化，冻干得产品。化合物1a-peg1000修饰物的结构测定数据如下：maldi-tof-msexpectedm.w.～4930,measuredm.w.～4921。

通过尾静脉注射含化合物1a-peg1000修饰物100μg的pbs溶液200μl进入右后肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠体内，近红外二区相机拍摄小鼠全身成像图，参见图4，肿瘤部位能够和其他组织明显区别，且成像时间快，10min左右肿瘤部位对探针有极高的摄取。本发明所述材料在快速诊断肿瘤方面具有较好的应用前景。

实施例5：化合物1a-rgd修饰物的制备及其肿瘤成像效果

取化合物1a(4mg，0.004mmol)、c(rgdfk)(2.4mg，0.004mmol，m.w.～1000)加入5ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入无水dmf1ml，搅拌使溶解，随后加入hbtu(3mg，0.08mmol)和dipea(10μl)，反应液在25℃搅拌反应24小时。c(rgdfk)是一种多肽，英文名字cyclo(arg-gly-asp-d-phe-lys)，hbtu是苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐。反应结束后加乙醚沉淀，收集固体，固体复溶于去离子水-乙腈(v/v，7:3)中，通过半制备型高效液相色谱纯化，冻干得产品。化合物1a-rgd修饰物的结构测定数据如下：maldi-tof-mscalcdfor:c72h79n15o14s4:1589.4814,found:1589.6691。

通过尾静脉注射含化合物1a-rgd修饰物150μg的pbs溶液200μl进入右后肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠体内，近红外二区相机拍摄小鼠全身成像图，参见图6，肿瘤部位能够和其他组织明显区别。为探究上述制备的化合物1a-rgd修饰物对肿瘤的主动靶向性，于另一只右后肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠尾静脉注射阻断试剂c(rgdfk)500μg的pbs溶液200μl，半小时后于尾静脉注射含化合物1a-rgd修饰物150μg的pbs溶液200μl，近红外二区相机拍摄小鼠全身成像图，参见图6，肿瘤部位没有荧光信号，阻断成功，化合物1a-rgd修饰物对肿瘤的主动靶向性极好。本发明所述材料在特异性诊断肿瘤方面具有较好的应用前景。

实施例6：化合物1a纳米粒的制备及其血管和淋巴结成像效果

取化合物1a溶于四氢呋喃中制成浓度为0.1mg/ml的储备液(a液)，取dspe-mpeg(5kda)溶于去离子水中制成浓度为1mg/ml的储备液(b液)。dspe-mpeg是聚乙二醇修饰磷脂。在超声下将a液缓慢滴入b液中，a液和b液按体积比1:9混合。混合均匀后在室温搅拌2小时，使之形成纳米粒。氮吹除去四氢呋喃，离心浓缩得化合物1a纳米粒。通过dls表征纳米粒粒径，大约为30～300nm，主要集中在50～150nm，参见图7。

通过尾静脉注射如上所述制作的含有荧光色素的纳米粒150μl进入右前肢接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠体内，近红外二区相机拍摄小鼠肿瘤部位和全身血管成像图，参见图8，肿瘤局部血管和小鼠全身血管清晰可见。本发明所述材料在新生肿瘤和血管疾病诊断方面具有较好的应用前景。

通过小鼠前足注射如上所述制作的含有荧光色素的纳米粒100μl进入正常小鼠体内，近红外二区相机拍摄前哨淋巴结成像图以及通过近红外荧光导航外科手术系统，切除小鼠前哨淋巴，具有非常好的识别效果，参见图9。本发明所述材料可辅助外科手术，提高外科手术准确度。