水相中铜离子荧光检测用杂化探针及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种水相中铜离子荧光检测用杂化探针及其制备方法，该杂化探针是一种将荧光检测基团罗丹明衍生物共价键嫁接到介孔二氧化硅纳米球无机基质中，并进行了表面聚乙二醇（PEG）改性，可实现水相中铜离子荧光检测的杂化探针。本发明所涉及的杂化荧光纳米探针的制备方法，反应条件温和，合成步骤简单。本发明所涉及的杂化荧光纳米探针可应用于水中铜离子的检测，具有抗干扰能力强、稳定性好、选择性高可实现单一铜离子检测，不存在共存离子影响，且荧光及颜色变化肉眼可见等优点。此外，本发明所涉及的杂化荧光纳米探针可应用于活细胞内Cu2+的荧光成像，在生命体中Cu2+的荧光检测，与Cu2+相关的疾病的早期诊断及致病机理研究上具有潜在的应用价值。
【专利说明】
水相中铜离子荧光检测用杂化探针及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种水相中铜离子荧光检测用杂化探针及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 铜元素是人体一种必需的微量元素，是机体内蛋白质和酶的重要组成部分，人体 内许多重要的酶都需要微量铜的参与和活化。例如，铜可以催化血红蛋白的合成。人体缺乏 铜会引起贫血，毛发异常，骨和动脉异常，以至脑障碍等。研究表明，缺铜会导致血浆胆固醇 升高，增加动脉粥样硬化的危险，因而是引发冠状动脉心脏病的重要因素。严重缺铜和长期 边缘性缺铜，还会引发小儿发育不良和一些地方病。然而，过量的铜摄入也会带来不良后 果，这是因为铜可以起到催化作用从而会加快活泼氧化物的生成而导致体内正常代谢紊 乱，会引起肝硬化、腹泻、呕吐、运动障碍和知觉神经障碍。与铜代谢相关的疾病包括Menkes 综合症、Wilson症、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ALS)等。因此，体内铜稳态平衡对于人 们的健康十分的重要。
[0003] 荧光检测具有便捷、灵敏度高、可进行裸眼观测、响应时间快、可实时实地检测等 优点，在分析化学、临床检验、细胞生物学、环境学等方面得到了广泛的应用。近年来，设计 合成荧光探针实现对铜离子的痕量检测仍然是一个热点研究领域。然而目前大部分荧光分 子探针存在结构复杂、合成步骤繁琐、产率较低、抗干扰能力低以及水溶性差等缺点，无法 实现纯水相或细胞内铜离子检测。因此，设计合成新型的水溶液中分散性好的杂化纳米探 针，实现水相中铜的痕量检测和细胞内荧光成像，将具有重要的研究意义和应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一克服现有有机荧光分子探针水溶性差，无法实现水相中铜的痕 量检测和细胞内荧光成像的缺点，提供一种以介孔二氧化硅纳米球为无机基质，以罗丹明 衍生物为荧光检测基团的水相中铜离子荧光检测用杂化探针。
[0005] 本发明的目的之二在于提供该杂化探针的制备方法 为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是： 一种水相中铜离子荧光检测用杂化探针，其特征在于该杂化探针是将荧光检测基团罗 丹明衍生物通过共价键嫁接到介孔二氧化硅纳米球无机基质中，并进行了表面聚乙二醇 (PEG)改性;所述的罗丹明衍生物、介孔二氧化硅纳米球和聚乙二醇的质量比为：1: (0.5~ 5):(0.5~5)〇
[0006]上述的罗丹明衍生物具有以下结构：
一种制备上述的水相中铜离子荧光检测用杂化探针的方法，其特征在于该方法的具体 步骤为： a. 将介孔二氧化硅纳米球与3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷按质量比为(30~10):1 的比例溶于甲苯中，回流反应12~24 h，将得到的产品离心分离后用乙醇洗涤3~5次，得到异 氰酸酯基修饰的介孔二氧化娃纳米球； b. 将步骤a所得到的异氰酸酯基修饰的介孔二氧化硅纳米球与罗丹明衍生物荧光分 子按质量比为(5~1):1的比例加入到有机溶液中，回流反应12~24 h，将得到的产品离心分 离后用乙醇洗涤3~5次，得到杂化纳米探针前体； c. 将步骤b所得到的杂化纳米探针前体与聚乙二醇(PEG)按质量比为（10~1):10的比 例溶解于水中，超声分散，然后继续搅拌12~24 h;将得到的产品离心分离后用水洗涤3~5 次，得到水相中铜离子荧光检测用杂化探针。
[0007] 上述步骤b中所用的有机溶剂为：甲苯、乙腈、四氢呋喃或无水吡啶。
[0008] 上述步骤C中所用的聚乙二醇为:PEG-1000、PEG-2000或PEG-5000。
[0009]上述的介孔二氧化硅纳米球的制备方法为:将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与三 乙醇胺（TEA)按1:0.4~2的质量比溶于纯水中，95°C反应卜2小时；随后将正硅酸乙酯 (TE0S)逐滴加入到上述反应液中，继续搅拌反应1~2小时;将得到的产品离心分离后得到白 色固体，将该白色固体溶于乙醇中，再加入NH4NO3，回流反应2~4 h，最终将白色固体洗涤干 燥，得到介孔二氧化硅纳米球;所述的十六烷基三甲基溴化铵、正硅酸乙酯和nh4no 3的质量 比为 1: (5~40): (1~5)。
[0010] 本发明所提供的一种用于水相中铜离子荧光检测的杂化探针的制备方法，具有如 下特征：1.反应条件温和，合成步骤少，产物产率高，原料价廉易得。2.以介孔二氧化硅纳米 粒子为基质可实现纳米探针水溶液中铜离子检测，并且提高了探针的稳定性。3.所制备的 纳米探针选择性好，灵敏度高，可实现单一铜离子检测，不存在共存离子影响，且荧光及颜 色变化肉眼可见。4.所制备的杂化纳米探针还可应用于活细胞内Cu 2+的荧光成像，在与Cu2 +相关疾病的早期诊断及致病机理研究上具有潜在的应用价值。
【附图说明】
[0011] 图1是实施例1中二氧化硅纳米球MSN，负载荧光染料后MSN@DFPP-RhB及杂化荧光 纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG的透射电镜图。
[0012] 图2是实施例1中二氧化硅纳米球MSN，负载荧光染料后MSN@DFPP-RhB及杂化荧光 纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG的氮气吸附-脱附等温线。
[0013] 图3是实施例1中二氧化硅纳米球MSN，负载荧光染料后MSN@DFPP-RhB及杂化荧光 纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG的热重图谱。
[0014] 图4是实施例3中杂化纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG加入不同金属离子后的紫外可 见吸收光谱。
[0015] 图5是实施例3中杂化纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG加入不同金属离子后的荧光光 谱。
[0016] 图6是实施例4中杂化纳米探针MSN@RH101@PEG的细胞荧光成像图。
【具体实施方式】
[0017] 为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明。这些实施例仅 起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
[0018] 实施例1:杂化纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG的制备及其表征。
[0019] (1)将0.05~0.50 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)与0.02~0.10 g三乙醇胺（TEA) 溶解在20 mL的纯水中，然后加热至95 °C进行反应。反应1~2个小时后，向反应体系中加入 1.5~5 mL的正硅酸乙酯，滴加完毕后继续反应1~2个小时，离心洗涤，得到白色固体。之后通 过快速离子交换的方法，将白色固体溶于乙醇中，再加入溶解有0.1 g~1.0 g NH4N03的乙醇 溶液，加热反应2~4 h，最终将白色固体洗涤干燥，得到介孔二氧化硅纳米球MSN。
[0020] (2)将上述步骤（1)所得到的介孔二氧化硅纳米球与3-异氰酸酯基丙基三乙氧基 硅烷按质量比为30:1~10:1的比例加入到甲苯溶液中，加热回流12~24 h，将得到的产品离 心分离后用乙醇洗涤3~5次，得到异氰酸酯基修饰的介孔二氧化硅纳米球。
[0021] (3)罗丹明B衍生物DFPP-RhB的合成，具体合成方法参考文献： Meng, X. F., Xu , Y. X., Liu , J. L., Sun , L. N., Shi , L. Y., A new fluorescent rhodamine B derivative as an "off-〇n" chemosensor for Cu2+with high selectivity and sensitivity. Anal. Methods, 2016,8, 1044-1051. 表征匪 R:S(氘代 DMS0) 9.14(s，2H，N=C-H)，7.90(m, 2H, ArH)，7.57(m, 6H, ArH), 7.29(m, 2H, ArH), 6.99(t, 2H, ArH), 6.29-6.50(m, 12H, ArH),4.30-4.54 (m, 5H, CH2CHCH2)，3.35(s，lH，0H), 3.23(q, 16H, NCH2CH3), 1.09(t,24H,NCH2CH3). (4)将上述步骤(2)所得到的异氰酸酯基修饰的介孔二氧化硅纳米球与上述步骤(3)所 合成的罗丹明B衍生物DFPP-RhB按质量比为5:1~1:1的比例加入到有机溶液中，加热回流12 ~24 h，将得到的产品离心分离后用乙醇洗涤3~5次，得到杂化纳米探针前体MSN@DFPP-RhB。 [0022] (5)将上述步骤所得的杂化纳米探针前体与PEG-5000按质量比为10:1~1:10的比 例进行如下的操作:首先将PEG-5000超声溶解于水中，然后逐滴加入上述步骤(4)所得到的 杂化纳米探针前体MSN@DFPP-RhB，接着超声0.5 h，之后转移至烧瓶中继续搅拌12 h。将得 到的材料用水洗涤3~5次，然后分散在水中，得到可用于水相中铜离子荧光检测的杂化探针 MSNODFPP-RhBOPEG。
[0023] (6)对于上述得到的杂化荧光纳米探针分别进行TEM、BET及热重等测试进行表征， 具体结果分别见附图1、附图2、附图3。
[0024] 实施例2:杂化纳米探针MSN0RH1010PEG的制备。
[0025] (1)将0.05~0.50 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)与0.02~0.10 g三乙醇胺（TEA) 溶解在20 mL的纯水中，然后加热至95 °C进行反应。反应1~2个小时后，向反应体系中加入 1.5~5 mL的正硅酸乙酯，滴加完毕后继续反应1~2个小时，离心洗涤，得到白色固体。之后通 过快速离子交换的方法，将白色固体溶于乙醇中，再加入溶解有0.1 g~1.0 g NH4N03的乙醇 溶液，加热反应2~4 h，最终将白色固体洗涤干燥，得到介孔二氧化硅纳米球MSN。
[0026] (2)将上述步骤（1)所得到的介孔二氧化硅纳米球与3-异氰酸酯基丙基三乙氧基 硅烷按质量比为30:1~10:1的比例加入到甲苯溶液中，加热回流12~24 h，将得到的产品离 心分离后用乙醇洗涤3~5次，得到异氰酸酯基修饰的介孔二氧化硅纳米球。
[0027] (3)罗丹明101酰肼的合成，具体合成方法参考文献： Xie, P. H., Guo, F. Q., Li, D., Liu, X. Y., Liu, L. A Cu2+ chemodosimeter based on amplified fluorescencehin the red region.J . L um i n .，2011，131， 104-108. (4)将上述步骤(2)所得到的异氰酸酯基修饰的介孔二氧化硅纳米球与上述步骤(3)所 合成的罗丹明101酰肼按质量比为5:1~1:1的比例加入到有机溶液(包括甲苯，乙腈，四氢呋 喃或者无水吡啶）中，加热回流12~24 h，将得到的产品离心分离后用乙醇洗涤3~5次，得到 杂化纳米探针前体MSN0RH101。
[0028] (5)将上述步骤所得的杂化纳米探针前体与PEG-2000按质量比为10:1~1:10的比 例进行如下的操作:首先将PEG-2000超声溶解于水中，然后逐滴加入上述步骤(4)所得到的 杂化纳米探针前体MSN0RH101，接着超声0.5 h，之后转移至烧瓶中继续搅拌12 h。将得到的 材料用水洗涤3~5次，然后分散在水中，得到可用于水相中铜离子荧光检测的杂化探针MSN0 RH1010PEG。
[0029] 实施例3:杂化纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG对铜离子的检测。
[0030] (1)称取实施例1中制备的杂化荧光纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG，配成1.0mg/mL的 水溶液。
[0031] (2)配制各种金属离子的浓溶液（Q.IM)，包括 Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Zn 2+，Li+，Mn2 +，Co2+，Hg2+等，及待检测离子Cu2+。
[0032] (3)选择性实验中，分别取一定当量的各种金属离子加入到2.0 mL的杂化荧光纳 米探针水溶液中，然后进行吸收光谱及荧光光谱测试，结果分别见附图4和附图5。
[0033] (4)滴定实验中，用移液管吸取2.0 mL杂化荧光纳米探针水溶液置于1.0 cmXl.O cm石英比色皿中，用微量进样器依次向溶液中加入Cu2+溶液，每加入一次进行一次紫外及荧 光光谱测试。
[0034] (5)竞争实验中，先将某种干扰离子加入到2.0 mL杂化荧光探针水溶液中，再加入 Cu2+，然后进行光谱测试。
[0035] 实施例4:杂化纳米探针MSNODFPP-RhBOPEG用于细胞荧光成像。
[0036] (1)对照组，配1.0 mg/mL的杂化荧光探针分子的RPMI. 1640溶液培养液； (2) 将Hela细胞在上述培养液中培养2.0小时； (3) 实验组，首先，用10 μΜ的Cu2+溶液培养Hela细胞0.5小时，然后，再用1.0 mg/mL的 杂化荧光探针培养液培养2.0小时； (4) 用roS缓冲液冲洗细胞3次，将没有被细胞吸收的培养液洗去； (5)将培养后的细胞在共聚焦显微镜上进行成像，用543 nm的激光激发，观察细胞荧光 成像，结果见图6。
[0037]图 1、图2为实施例1 中 MSN、MSN@DFPP-RhB 和 MSNODFPP-RhBOPEG 的透射电镜图（TEM) 及氮气吸附-脱附等温线，从图中可以看出，得到的二氧化硅粒子为介孔材料，粒径均一分 散良好，粒子大小约为50 nm，孔径大约在2.7 nm，即使嫁接上染料以后，粒径大小没有多大 变化，粒子分散依旧良好，孔道依然可见，然而孔径减小至1.9 nm左右，可能是由于嫁接的 罗丹明B衍生物探针分子占据了部分孔道。
[0038]图3为实施例1中杂化荧光纳米探针热重图，从图谱上可以看出大约有17.5%(质量 百分比）的罗丹明B衍生物探针分子嫁接到MSN上，有2.6%的PEG包裹在纳米二氧化硅介孔球 上。
[0039]图4、图5分别为检测铜离子的选择性实验中紫外-可见吸收光谱及荧光光谱图。从 紫外可见吸收及荧光光谱可以看出，此杂化荧光探针只对铜离子有响应，而对其他金属离 子几乎无响应。
[0040] 图6为杂化荧光探针检测铜离子的HeLa细胞成像。由图中可以看出，当只用杂化探 针培养细胞时，细胞无荧光;而先用Cu2+培养细胞后，再用探针培养细胞后，细胞展现出明显 的荧光增强，从而表明了此杂化荧光探针可以成功地检测HeLa细胞内铜离子并实现细胞成 像。
[0041] 如上所述仅为本发明的几个具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精 神和原则之内，采用与其相同或相似方法所得到的以介孔二氧化硅纳米球为无机基质，以 罗丹明衍生物为荧光检测基团，用于水相中铜离子荧光检测的杂化探针的制备方法，均在 本发明保护范围内。
【主权项】
1. 一种水相中铜离子巧光检测用杂化探针，其特征在于该杂化探针是将巧光检测基团 罗丹明衍生物通过共价键嫁接到介孔二氧化娃纳米球无机基质中，并进行了表面聚乙二醇 (PEG)改性;所述的罗丹明衍生物、介孔二氧化娃纳米球和聚乙二醇的质量比为：1: (0.5~ 5):(0.5~5)。2. 根据权利要求1所述的水相中铜离子巧光检测用杂化探针，其特征在于所述的罗丹 明衍生物具有W下结构：3. -种制备根据权利要求1所述的水相中铜离子巧光检测用杂化探针的方法，其特征 在于该方法的具体步骤为： a. 将介孔二氧化娃纳米球与3-异氯酸醋基丙基Ξ乙氧基硅烷按质量比为（30~10):1 的比例溶于甲苯中，回流反应12~24 h，将得到的产品离屯、分离后用乙醇洗涂3~5次，得到异 氯酸醋基修饰的介孔二氧化娃纳米球； b. 将步骤a所得到的异氯酸醋基修饰的介孔二氧化娃纳米球与罗丹明衍生物巧光分 子按质量比为（5~1) : 1的比例加入到有机溶液中，回流反应12~24 h，将得到的产品离屯、分 离后用乙醇洗涂3~5次，得到杂化纳米探针前体； C.将步骤b所得到的杂化纳米探针前体与聚乙二醇(PEG)按质量比为（10~1):10的比 例溶解于水中，超声分散，然后继续揽拌12~24 h;将得到的产品离屯、分离后用水洗涂3~5 次，得到水相中铜离子巧光检测用杂化探针。4. 根据权利要求1所述的水相中铜离子巧光检测用杂化探针的制备方法，其特征在于 所述步骤b中所用的有机溶剂为：甲苯、乙腊、四氨巧喃或无水化晚。5. 根据权利要求1所述的水相中铜离子巧光检测用杂化探针的制备方法，其特征在于 上述步骤C中所用的聚乙二醇为:PEG-1000、PEG-2000或PEG-5000。6. 根据权利要求1所述的水相中铜离子巧光检测用杂化探针的制备方法，其特征在于 所述的介孔二氧化娃纳米球的制备方法为：将十六烷基Ξ甲基漠化锭(CTAB)与Ξ乙醇胺 (TEA)按1:0.4~2的质量比溶于纯水中，95°C反应1~2小时；随后将正娃酸乙醋(TEOS)逐滴 加入到上述反应液中，继续揽拌反应1~2小时;将得到的产品离屯、分离后得到白色固体，将 该白色固体溶于乙醇中，再加入N也N03，回流反应2~4 h，最终将白色固体洗涂干燥，得到介 孔二氧化娃纳米球;所述的十六烷基Ξ甲基漠化锭、正娃酸乙醋和N也M)3的质量比为1: (5~ 40):心5)。
【文档编号】C09K11/06GK106085409SQ201610406749
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】施利毅, 刘金亮, 孟宪福, 孙丽宁, 徐艳霞
【申请人】上海大学