检测次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法与使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测次氯酸根离子的荧光探针及其 制备方法与使用方法。
【背景技术】
[0002] 次氯酸根(CKT)是一种常见的非亲核性氧化剂，是工业和日常生活中广泛使用的 清洁剂和抗菌剂的主要成分，也是生物体免疫系统最关键的活性氧物种(R0S)。在生命体 内，次氯酸根(CKT)参与了细胞内氧化还原反应和多种信号传导过程，包括血管舒张、心肌 收缩、神经传递和胰岛素分泌等。而当细胞内次氯酸根(CKT)处于非正常水平时将导致一 系列生理疾病，例如关节炎、神经衰弱和癌症等（参见Imada，I. ;Sato，E.F. ;Miyamoto，M.; Ichimori,Y.；Minamiyama,Y.；Konaka,R.；and Inoue，M.Anal·Biochem.，1999，271，53-58; Shepherd,J.；Hilderbrand,S. A.；ffaterman,P.；Heinecke,J.ff.；ffeissleder,R.；and Libby，P.Chem.Biol.，2007,14,1221-1231)。因此，有效地检测或监控生物样品或环境样品 中的次氯酸根(CKT)已成为近年来相关领域的研究热点。
[0003] 荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在 线检测而受到研究者的广泛关注。2_(2'_羟基苯基)苯并噻唑类荧光分子因其具有良好的 光稳定性、高摩尔消光系数和量子产率以及具有独特的激发态分子内质子转移(ESIPT)等 独特光学性质而成为该方法最重要的荧光母体之一，在多种待测分子的荧光检测中得到了 广泛的应用。
[0004]目前已开发的用于检测次氯酸根（CKT)的小分子荧光探针主要基于次氯酸根 (CKT)与还原性官能团之间的特异性化学反应而设计的。当存在次氯酸根(CKT)的条件下， 探针分子中的还原性官能团（如:硫醚，硒醚，肟，亚胺等等)被次氯酸根(CKT)氧化为高价 态原子(如硫醚和硒醚等)或是发生键的断裂(如:肟，亚胺等等），导致探针分子的荧光性质 发生变化，从而实现对次氯酸根(CKT)的特异性设别。
[0005] 然而，基于硫醚，硒醚为探针报告基团的探针(参见Yu，F. ; Li，P. ; Li，G. ; Zhao，G.; Chu,T.；Han,K.J.Am.Chem.Soc.,2011,133,11030-11033；Manjare,S.T.；Kim,S.；Heo, W.D. ;Churchill，D.G. Org. Lett. ,2014,16,410-412)易受到生物体中其它活性氧物种 (R0S)的影响。而基于肟，亚胺等为探针报告基团的探针由于亚胺在酸性条件下易于水解而 易受到pH环境的影响，不利于其在复杂的生物体内进行检测。因此亟须一种新颖的、具有良 好生物稳定性的且能实现生物体内在线检测的次氯酸根(CKT)荧光探针。
【发明内容】
[0006] 本发明为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种检测次氯酸根离子 的荧光探针及其制备方法与使用方法。
[0007] 本发明的核心在于利用2_(2'_羟基苯基）苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在 5'_位直接引入偶氮苯基部分，使其更具生物和光学稳定性。探针本身的ESIPT效应被偶氮 苯基抑制而无荧光发射，但当存在次氯酸根(cun的条件下，偶氮基被次氯酸根(cun氧 化，进而使其抑制作用消失，探针分子发射出强荧光，通过上述方案，获得了"开-关"型的荧 光响应，实现了对次氯酸根(CKT)的高灵敏、特异性检测。
[0008] 本发明为一种检测次氯酸根(CKH的荧光探针，结构式为式（I)或者式（II)，式 (I)为2-( 2 ' -羟基苯基)苯并噻唑-5 ' -偶氮苯衍生物；
[0009]
[0010] 式（I)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸基中的任 何一种。
[0011] (II)所示化合物(SCI):
[0012]
[0013] -种检测次氯酸根(CKT)的荧光探针的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0014] 步骤一:在弱碱性条件下，式(III)所示水杨醛与式（IV)所示苯基重氮化合物在水 中反应得到式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛；
[0015]
[0016] 式（IV)与式(V)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸 基中的任何一种。
[0017] 步骤二:在惰性气氛下，在双氧水的存在下，式(V)所示化合物与2-氨基苯硫酚在 醇中反应即得式(I)所示化合物；
[0018] 步骤一中所述式（III)所示水杨醛和式（IV)所述苯基重氮化合物的摩尔比为1~ 10:1;所述苯基重氮化合物为氯盐;步骤一的反应温度为-10~25度;反应时间为0.1~5小 时；
[0019] 作为优选步骤一的反应温度为0度;反应时间为0.5小时;式(III)所示水杨醛和式 (IV)所述苯基重氮化合物的摩尔比为2:1;
[0020] 步骤二中所述醇为甲醇，乙醇，叔丁醇，异丙醇;式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水 杨醛和所述2-氨基苯硫酚的摩尔比为0.5~2:1;步骤二的反应温度为0~50度;反应时间为 1~20小时；
[0021] 作为优选该步骤二的反应温度为30度，反应时间为5小时，醇为乙醇;式(V)所示取 代的5-偶氮基苯基水杨醛和所述2-氨基苯硫酚的摩尔比为0.8:1;
[0022] -种检测次氯酸根(CKT)的荧光探针的使用方法;该方法具体包括以下步骤：
[0023] 步骤1:向不同浓度次氯酸根(CKT)的缓冲溶液中加入相同浓度的式（I)所示化合 物，配置至少5种不同次氯酸根(CKT)含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；
[0024] 所示缓冲溶液以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；
[0025] 所示标准溶液的pH值为5~11;
[0026] 所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为InM~ΙμΜ;
[0027] 所示标准溶液中次氯酸根(CIO-)的含量为0.1 nM~ImM;
[0028] 步骤2:分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为400nm，以次氯酸根 (CKT)浓度为横坐标，以1466为纵坐标，建立标准曲线；
[0029] 1466表不所述标准溶液在波长为466nm处的焚光发射峰强度值；
[0030] 步骤3:向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I) 所示化合物的浓度相等;测定其在激发波长为400nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准 曲线计算得出待测样品的次氯酸根(CKT)含量。
[0031] 本发明具有如下特点：
[0032] 1)本发明提供的荧光探针是黄色固体粉末，分子结构的中偶氮基团保证了探针的 结构和光学稳定性。
[0033] 2)本发明提供的荧光探针，其溶液对次氯酸根(CKT)的浓度敏感，随着次氯酸根 (CKT)浓度的增加，紫外灯下观察到其水溶液的荧光由无色变为蓝色。
[0034] 3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为466nm，为荧光"开-关"型响应，能大大消 除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。
[0035] 4)本发明提供的荧光探针对次氯酸根(CKT)浓度呈线性关系，可用于次氯酸根 (CKT)的精确测量。
[0036] 本发明提供的2_(2'_羟基苯基）苯并噻唑-偶氮类染料的"开-关"型次氯酸根 (CKT)探针及其试剂盒对次氯酸根(CKT)溶液具有良好的响应，能够实现对细胞内次氯酸 根(CKT)的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
【附图说明】
[0037] 图1为实施例1制备的荧光探针SCI的合成路线。
[0038] 图2为实施例6制备的SCI试剂盒对次氯酸根(CKT)水溶液的颜色响应图。
[0039] 图3为实施例6制备的SCI试剂盒对不同次氯酸根(CKT)水溶液的荧光响应图。
[0040] 图4为实施例6制备的SCI试剂盒在波长466nm下的荧光发射强度与次氯酸根 (CKT)浓度关系曲线。
[0041 ]图5为实施例6制备的SCI试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。
[0042] 图6为实施例6制备的SCI试剂盒对细胞内次氯酸根(CKT)的荧光成像图；其中， (a)为未加 SCI之前的细胞荧光成像图；（b)为加入SCI后的细胞荧光成像图；（c)为加入SCI 和次氯酸根(CKT)后细胞荧光成像图。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
[0045] 如图1所示，实施例1、荧光探针SCI的制备
[0046] 步骤a):在0度下，将6.10g水杨醛加入到300mL 5%氢氧化钠的水溶液中，再向溶 液中滴加3.5lg苯基重氮氯盐，搅拌反应0.5小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三 次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛6.90g(产率为61 % )。
[0047]步骤b):在惰性气氛下，将0.40g 5-偶氮基苯基水杨醛和0.28g 2-氨基苯硫酚加 入到7mL乙醇中，室温搅拌反应5小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出，过滤， 洗涤，真空干燥，得到最后产物SC1420mg(产率为57 % )，黄色固体。
[0048] = 7.88(m，3H)，7.55-7.49(m，3H)，7.47(d，J = 7.0Hz，lH)，7.42(t，J = 7.8Hz，lH)，7.20(d，J = 8.9Hz，1H);13C 匪R(100MHz，Chloroform-d)Sl68.92，160.54，152.58，151.58，145.72， 132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68， 116.75;HRMS(ESI-T0F):m/z 331.0781[M+H]+，calc'd.331.0779。
[0049] 实施例2、荧光探针SCI的制备
[0050] 步骤a):在-10度下，将5.00g水杨醛加入到300mL 5%氢氧化钠的水溶液中，再向 溶液中滴加5.76g苯基重氮氯盐，搅拌反应0.1小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤 三次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛2.30g(产率为25% )。
[00511步骤b):在惰性气氛下，将0.40g 5-偶氮基苯基水杨醛和0.44g 2-氨基苯硫酚加 入到7mL甲醇中，于0度下搅拌反应1小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出，过 滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SCI270mg(产率为23 % )，黄色固体。
[0052] ΧΗ NMR(400MHz,Chloroform-d)58.30(d,J=2.1Hz,lH),8.03-7.97(m,2H),7.94-7.88(m,3H),7.55-7.49(m,3H),7.47(d ,J = 7.0Hz,lH),7.42(t ,J = 7.8Hz,lH),7.20(d ,J = 8.9Hz，1H);13C 匪R(100MHz，Chloroform-d)Sl68.92，160.54，152.58，151.58，145.72， 132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65