,118.68， 116.75;HRMS(ESI-T0F):m/z 331.0781[M+H]+，calc'd.331.0779。
[0053] 实施例3、荧光探针SCI的制备
[0054] 步骤a):在25度下，将5.OOg水杨醛加入到300mL 5%氢氧化钠的水溶液中，再向溶 液中滴加〇.58g苯基重氮氯盐，搅拌反应5小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三 次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛1.80g(产率为20% )。
[0055]步骤b):在惰性气氛下，将0.40g 5-偶氮基苯基水杨醛和0.10g 2-氨基苯硫酚加 入到7mL叔丁醇中，于50度下搅拌反应20小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析 出，过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SCI 120mg(产率为41 % )，黄色固体。
[0056] ΧΗ NMR(400MHz,Chloroform-d)58.30(d,J=2.1Hz,lH),8.03-7.97(m,2H),7.94-7.88(m,3H),7.55-7.49(m,3H),7.47(d ,J = 7.0Hz,lH),7.42(t ,J = 7.8Hz,lH),7.20(d ,J = 8.9Hz，1H);13C 匪R(100MHz，Chloroform-d)Sl68.92，160.54，152.58，151.58，145.72， 132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68， 116.75;HRMS(ESI-T0F):m/z 331.0781[M+H]+，calc'd.331.0779。
[0057] 实施例4、荧光探针SCI的制备
[0058] 步骤a):在-5度下，将5.OOg水杨醛加入到300mL 5%氢氧化钠的水溶液中，再向溶 液中滴加1.15g苯基重氮氯盐，搅拌反应1小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三 次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛1.10g(产率为59% )。
[0059]步骤b):在惰性气氛下，将0.40g 5-偶氮基苯基水杨醛和0.22g 2-氨基苯硫酚加 入到7mL异丙醇中，于30度下搅拌反应10小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析 出，过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SCI320mg(产率为55 % )，黄色固体。
[0060] ΧΗ NMR(400MHz,Chloroform-d)58.30(d,J=2.1Hz,lH),8.03-7.97(m,2H),7.94-7.88(m,3H),7.55-7.49(m,3H),7.47(d ,J = 7.0Hz,lH),7.42(t ,J = 7.8Hz,lH),7.20(d ,J = 8.9Hz，1H);13C 匪R(100MHz，Chloroform-d)Sl68.92，160.54，152.58，151.58，145.72， 132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68， 116.75;HRMS(ESI-T0F):m/z 331.0781[M+H]+，calc'd.331.0779。
[0061] 实施例5、荧光探针SCI的制备
[0062] 步骤a):在10度下，将5.OOg水杨醛加入到300mL 5%氢氧化钠的水溶液中，再向溶 液中滴加〇.72g苯基重氮氯盐，搅拌反应3小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三 次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛0.50g(产率为43% )。
[0063]步骤b):在惰性气氛下，将0.40g 5-偶氮基苯基水杨醛和0.15g 2-氨基苯硫酚加 入到7mL乙醇中，于20度下搅拌反应15小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出， 过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SCI220mg(产率为56 % )，黄色固体。
[0064] = 7.88(m，3H)，7.55-7.49(m，3H)，7.47(d，J = 7.0Hz，lH)，7.42(t，J = 7.8Hz，lH)，7.20(d，J = 8.9Hz，1H);13C 匪R(100MHz，Chloroform-d)Sl68.92，160.54，152.58，151.58，145.72， 132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68， 116.75;HRMS(ESI-T0F):m/z 331.0781[M+H]+，calc'd.331.0779。
[0065] 实施例6、式(I)所示化合物的光谱性质
[0066] 称取3.9mg SC1，溶于10mL DMS0,配成母液（ImM)，即得到SCI试剂盒。将100yL的此 母液滴加到不同浓度次氯酸根(CKT)的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到 l〇mL。测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以400nm进行激发，发射峰的强度为1466 ; 激发和发射的狭缝宽度分别为3/5。
[0067] 图2为SCI试剂盒对次氯酸根(CKT)水溶液的颜色响应图。由图2知，当加入次氯酸 根(CKT)水溶液后，肉眼观察到溶液的颜色由深黄色变为浅黄色，同时溶液的荧光也由几 乎无荧光变为亮蓝色荧光。证明本发明试剂盒对次氯酸根(CKT)具有直观的显色响应。
[0068] 图3为SCI试剂盒对不同次氯酸根(CKT)水溶液的荧光响应图。由图3知，随着次氯 酸根(CKT)浓度的增加，波长为466nm处的发射峰的荧光强度逐渐增大，证明本发明试剂盒 对次氯酸根(CKT)具有灵敏的荧光"开-关"型响应。
[0069] 图4为SCI试剂盒在波长466nm下的荧光发射强度1466与次氯酸根(CKT)浓度的关 系曲线。由图4知，随着水溶液中次氯酸根(C10_)浓度的增加，荧光在波长466nm下的发射强 度1 466逐渐增大。在次氯酸根(CKT)浓度为0~O.lmM的范围内，发射峰的荧光强度I·与水 溶液中次氯酸根(CKT)的浓度呈良好的线性关系(R 2 = 0.99428)。证明本发明试剂盒可以对 次氯酸根(CKT)进行准确测量。
[0070] 图5为SCI试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。由图5知，常见共存 阳离子、阴离子、生物小分子的加入并不能使溶液的焚光在波长466nm下的发射强度1466发 生改变。证明本发明试剂盒对次氯酸根(CKT)具有优秀的选择性。
[0071] 实施例7、细胞内次氯酸根(CKT)含量的测定
[0072] 1)在37度和5% (v/v)C02条件下，用含有10% (v/v)FBS(胎牛血清）、100U/mL盘尼 西林、100yg/mL的链霉素的DMEM培养基培养HeLa细胞。细胞使用前用PBS缓冲液清洗。
[0073] 2)在HeLa细胞中加入PBS(pH 7.4)，再加入3(：1(5以]\〇孵育3〇1^11，用？83洗三遍后， 进行共聚焦荧光成像，其中激发波长为400nm，收集波段为400-650nm。然后，向上述HeLa细 胞中再加入NaClO(lOyM)的磷酸缓冲盐溶液，继续孵育30min后，在激光共聚焦显微镜上进 行成像，其中激发波长为400nm，收集波段为400-650nm〇
[0074] 由图6知，载有SCI的细胞在未加次氯酸根(C1(T)之前几乎无荧光发射，表明SCI具 有很好的生物相容性和光学稳定性。而当加入次氯酸根(CKT)以后，细胞呈现明显的蓝色 荧光发射，表明SCI具有良好的细胞膜通透性并可以在细胞内与次氯酸根(CKT)发生特异 性响应。证明本发明试剂盒可以对细胞内的次氯酸根(CKT)进行检测。
[0075] 最后应说明的是，上述实施例仅举出以SCI化合物为荧光试剂，其余荧光试剂由于 结构与性质相近，其浓度、实验激发波段选择不一一列出，然而其并非用于限定本发明。任 何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当以作出各种修改和变 更。
【主权项】
1. 检测次氯酸根的荧光探针，其特征在于:该荧光探针的结构式为式(I);式（I)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸基中的任何一 种。2. 根据权利要求1所述检测次氯酸根的荧光探针，其特征在于:其结构式如式(II)，3. 检测次氯酸根的荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 步骤一:在弱碱性条件下，式（III)所示水杨醛与式（IV)所示苯基重氮化合物在水中反 应得到式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛；式（IV)与式(V)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸基中 的任何一种； 步骤二:在惰性气氛下，在双氧水的存在下，式(V)所示化合物与2-氨基苯硫酚在醇中 反应即得式(I)所示化合物； 步骤一中所述式（III)所示水杨醛和式（IV)所述苯基重氮化合物的摩尔比为1~10:1; 所述苯基重氮化合物为氯盐;步骤一的反应温度为-10~25度;反应时间为0.1~5小时； 步骤二中所述醇为甲醇，乙醇，叔丁醇，异丙醇;式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛 和所述2-氨基苯硫酸的摩尔比为0.5~2:1;步骤二的反应温度为0~50度;反应时间为1~ 20小时。4. 根据权利要求3所述的检测次氯酸根的荧光探针的制备方法;其特征在于： 步骤一中，反应温度为〇度;反应时间为0.5小时；，式(III)所示水杨醛和式（IV)所述苯 基重氮化合物的摩尔比为2:1。5. 根据权利要求3所述的检测次氯酸根的荧光探针的制备方法;其特征在于： 步骤二中，反应温度为30度，反应时间为5小时，醇为乙醇;式(V)所示取代的5-偶氮基 苯基水杨醛和所述2-氨基苯硫酚的摩尔比为0.8:1。6. 检测次氯酸根的荧光探针的使用方法;其特征在于： 步骤1:向不同浓度次氯酸根(CKT)的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配 置至少5种不同次氯酸根(CKT)含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液； 所示缓冲溶液以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸 钠缓冲溶液； 所示标准溶液的pH值为5~11; 所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为InM~ΙμΜ; 所示标准溶液中次氯酸根(CKT)的含量为〇. InM~ImM; 步骤2:分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为400nm，以次氯酸根(CKT) 浓度为横坐标，以1466为纵坐标，建立标准曲线； 1466表不所述标准溶液在波长为466nm处的焚光发射峰强度值； 步骤3:向待测样品中加入式（I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式（I)所示 化合物的浓度相等;测定其在激发波长为400nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线 计算得出待测样品的次氯酸根(CKT)含量。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在5’-位直接引入偶氮苯基部分，使其更具生物和光学稳定性。当存在次氯酸根的条件下，偶氮苯基被氧化，进而使探针分子发出强荧光，本发明提供的2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑类染料的“开-关”型次氯酸根探针及其专用检测试剂盒对次氯酸根溶液具有良好的响应，并能够实现对细胞内次氯酸根的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
【IPC分类】C09K11/06, G01N21/64, C07D277/66
【公开号】CN105441065
【申请号】CN201510794522
【发明人】韩益丰, 潘怡民, 陈宇, 章世深
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月18日