一种七甲川菁类近红外荧光分子探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于生化检测领域，特别涉及一种新的近红外荧光分子探针，还涉及该分子探针的制备方法及其在细胞成像中的应用。
背景技术：
：近红外(NIR)荧光成像技术在细胞生物学、药理学、疾病的诊断等方面有广泛的应用。近红外荧光成像技术作为一种非侵入性诊断技术，具有无辐射、无损、实时、在位检测生物信息等优点。许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光，严重干扰生物样品的荧光检测和造影，近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600～900nm，可避免背景的干扰。所以，近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性。近年来，近红外荧光成像发展的主要方向包括制备新的生物相容性好的近红外荧光染料，合成新的特异性靶向探针。在多项研究中，大量近红外荧光探针被开发出来，包括有机荧光染料、无机和生物纳米粒子等。在当前有机近红外荧光染料相关的研究中，含吲哚环的多甲川菁类化合物是一类重要的且使用广泛的近红外荧光染料。其中最具有代表性应用的最广的是吲哚菁绿(IndocyanineGreen，ICG)。自美国食品药品管理局(FDA)批准ICG用于临床后，ICG类有机近红外荧光染料得到了极大的关注。ICG是一种全合成的三羧花青系诊断试剂，1955年由美国柯达实验室研发，因其毒性低、副作用小，广泛用于心脏功能、肝功能和视网膜血管造影。最近，ICG也被用来作为一种潜在的光敏剂。然而ICG的应用也存在一定的限制如低量子产率，体内光不稳定性和在血管中的泄露等。因此，许多课题组开始研究ICG衍生物来提高体内外成像的亮度、溶解性、耐光性和光稳定性等。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种结构新颖的七甲川菁类近红外荧光分子探针，能够增强荧光强度，提高细胞成像效果。本发明的另一个目的是提供所述近红外荧光分子探针的合成方法及应用。技术方案：本发明所述的七甲川菁类近红外荧光分子探针，结构如式(Ⅴ)所示：本发明还提供了所述的七甲川菁类近红外荧光分子探针的制备方法，包括：(1)有机溶剂中，在惰性气体保护下，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐与对硝基苄溴反应，得式(Ⅲ)化合物：(2)有机溶剂中，在惰性气体保护下，式(Ⅲ)化合物与2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯反应，得所述的式(Ⅴ)化合物。步骤(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐具体可以为2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾，结构为：惰性气体可以为任何不参与反应的气体，如氮气、氩气等。步骤(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐与对硝基苄溴的摩尔比为1：1-4；所述的有机溶剂为甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、邻二氯苯和1,4-二氧六环中的一种或几种。步骤(1)中，反应温度为85-100℃，优选为85-90℃；反应时间为15-36h。步骤(2)中，式(Ⅲ)化合物与2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯的摩尔比为2～3:1。2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯的结构为步骤(2)中，所述的有机溶剂为乙醇、醋酸酐、吡啶、正丁醇和甲苯中的一种或几种。惰性气体可以为任何不参与反应的气体，如氮气、氩气等。步骤(2)中，还可以添加催化剂无水醋酸钠，催化剂的物质的量与式(Ⅲ)化合物的物质的量相同。步骤(2)中，反应温度为70～75℃，反应时间为4-8h。步骤(2)反应结束后，需在反应体系中纯化分离得所述的式(Ⅴ)化合物，所述纯化分离的方法包括：将反应后的溶液降至室温，减压浓缩后加入醚类溶剂，过滤，然后再经固体经色谱柱进行分离纯化，干燥得所述的式(Ⅴ)化合物。其中，所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，优选乙醚、甲基叔丁基醚，醚类溶剂加入量可根据需要选择，优选地为减压浓缩后的反应液的体积的3-5倍。所述的色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比为8:1-12:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或为体积比2:1-4:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。本发明还提供了所述的七甲川菁类近红外荧光分子探针在活细胞成像中的应用。所述的细胞具体可以为肺癌细胞如A549细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的近红外荧光分子探针，不仅吲哚环上引入-SO3H这种强吸电子基团，而且在七甲川链两端周围空间引入了体积较大的苄基和对位的硝基，增大了染料的stock位移，进一步增强其分子荧光强度，改善其在细胞内的成像效果。本发明提供的近红外荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好、细胞膜渗透性好，能够作为检测生物成像的近红外荧光探针。该荧光分子探针在分析化学、生命科学、环境科学等领域具有较强的实际应用价值。附图说明图1是本发明的近红外荧光分子探针的1HNMR图；图2是本发明的近红外荧光分子探针的MS图；图3a是本发明的近红外荧光分子探针的紫外吸收光谱图；图3b是本发明的近红外荧光分子探针的荧光发射光谱图；图4是本发明的近红外荧光分子探针对A549细胞的细胞毒性图；图5为本发明的近红外荧光分子探针在活的A549细胞内成像图；a是本发明的近红外荧光分子探针在活的A549细胞内成像图，b是与之对应的明场细胞成像图；c是吲哚菁绿在活的A549细胞内成像图，d是与之对应的明场细胞成像图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐释本发明。本发明具体实施方式中近红外荧光分子探针的合成反应方程式如下：实施例1向50ml单口烧瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾)、4.17mmol化合物2(对硝基苄溴)和10ml甲苯，在氩气的保护下，90℃反应16h，降至室温，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥得到0.94g棕红色固体(化合物3，1-对硝基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)，产率78.3％。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯)加入到100ml的反应瓶中，加入30ml正丁醇：甲苯＝7:3的混合溶剂中，在氩气的保护下，75℃下加热回流反应6h，溶液由浅红色变成深红色最后有大量绿色组分出现，降至室温，减压浓缩后加入浓缩后反应液3倍体积的乙醚过滤，滤饼用柱层析(硅胶柱，硅胶的规格为200-300目)分离提纯，洗脱液为体积比为12:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.31g深绿色固体为近红外荧光分子探针，命名为IR789探针。收率：35.4％。氢谱谱图见图1，质谱谱图见图2。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。其吸收光谱见图3a，其发射光谱见图3b。实施例2向50ml单口烧瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾)、8.34mmol化合物2(对硝基苄溴)和10ml甲苯，在氩气的保护下，90℃反应15h，降至室温，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥得到0.92g棕红色固体(化合物3，1-对硝基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯)加入到100ml的反应瓶中，加入30ml无水乙醇溶剂，再加入1.98mmol的无水醋酸钠作为催化剂，在氩气的保护下，75℃下回流反应4h，反应液呈棕色，降至室温，减压浓缩后加入浓缩后反应液4倍体积的乙醚，过滤，滤饼用柱层析(硅胶柱，硅胶的规格为200-300目)分离提纯，洗脱液为体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.21g深绿色固体为近红外荧光分子探针。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。实施例3向50ml单口烧瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾)、12.51mmol化合物2(对硝基苄溴)和15ml甲苯，在氩气的保护下，85℃反应36h，降至室温，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥得到0.88g棕红色固体(化合物3，1-对硝基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲酰基-2-羟甲基环己烯)加入到100ml的反应瓶中，加入30ml吡啶做反应溶剂，在氩气的保护下，75℃下回流反应8h，降至室温，减压浓缩后加入浓缩后反应液5倍体积的乙醚，过滤，滤饼用柱层析(硅胶柱，硅胶的规格为200-300目)分离提纯，洗脱液为体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.23g深绿色固体为近红外荧光分子探针。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。实施例4本发明还合成了化合物1a，结构为：除原料外合成方法参照实施例1，具体合成路线如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.58(m,2H),1.72(s,12H),2.09(t,4H),5.52(s,4H),6.36-6.40(d,J＝13.6Hz,2H),7.26-7.40(m,12H),7.62-7.64(d,2H),7.85(s,2H),8.22-8.25(d,J＝13.6Hz,2H)。TOF-MSm/z:794.2[M+H]-。表1染料吸收波长(nm)发射波长(nm)斯托克斯(stokes)位移(nm)IR789789824351a78380320由表1的结果可知，化合物1a因其斯托克斯(stokes)位移非常小，在20nm左右，造成荧光自淬灭，IR789的斯托克斯(stokes)位移更大，不容易发生荧光自淬灭，IR787与其相比具有更好的效果。实施例5体外细胞毒性实验检测近红外荧光分子探针IR789对人肺癌上皮细胞系A549细胞活性的影响。在100mlPBS的培养基中，加入0.5gMTT溶解，用滤膜过滤以除去溶液里的细菌，4℃避光保存。用含10％PBS的培养液将细胞株配成单细胞悬液，以每孔体积100ul，约1×104个细胞，接种到96孔板，在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养观察1d。观察细胞，待细胞贴壁后，开始实验处理。实验设置空白对照组、阳性对照组(吲哚菁绿ICG)和IR789实验组，并加入相应受试物，处理培养24h后，每孔加15ul预先配置好的MTT溶液(5mg/m1)。继续孵育4h，终止培养，用吸管小心吸出孔内培养的上清液。然后每孔加150ul的DMSO，在7℃培养箱孵育30min，振荡10min，使结晶物充分融解。在酶标仪上检测490nm波长下吸光度值(D)，每组重复5次取平均值。实验结果见图4，结果表明，与ICG相比，IR789对A549细胞的毒性没有显著性差异。IR789浓度为10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、120nM处理24h后的细胞存活率分别为95.64％，94.75％，96.35％，101.29％，95.54％，75.06％。细胞毒性实验表明IR789有很好的生物相容性，是安全低毒的。实施例6应用本发明近红外荧光分子探针在活的A549细胞内成像，检测该探针是否能在生物体中成像。将A549置于玻璃基底的培养液中，37℃在A549细胞中加入本发明近红外荧光分子探针(10μM)和ICG(10μM)孵育30min，然后用PBS缓冲溶液(pH7.4)冲洗3遍。在激发波长为789nm下观察探针在A549细胞中的荧光分布情况，在激发波长为805nm下观察ICG在A549细胞中的荧光分布情况。从图(5a，5c)中我们可以看到本发明近红外荧光分子探针和ICG可以透过细胞膜，都呈现出较强的荧光信号，但本发明近红外荧光分子探针的荧光强度相比于ICG提高了25.78％。而在明场图片中(图5b，5d)A549细胞状态与图(5a，5c)是一致的。实验结果证实，本发明近红外荧光分子探针有很好的细胞膜渗透性，在细胞内呈现较强的荧光，能够用于活细胞的近红外荧光成像。当前第1页1 2 3