一种镉离子和抗坏血酸检测用的碳量子点/金团簇比率荧光探针的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种镉离子和抗坏血酸检测用的碳量子点/金团簇比率荧光探针。制备方法为将丙氨酸和组氨酸通过一步水热法制得CQDs，再用3?氨丙基三乙氧基硅烷对CQDs氨基功能化，作为参比发色团；以11?巯基十一烷酸为表面活性剂，通过硼氢化钠还原氯金酸得MUA修饰的AuNCs，作为该比率荧光探针的主要荧光团；最后通过酰胺反应偶联CQDs和AuNCs，制得CQDs/AuNCs比率荧光探针。基于静态猝灭和内过滤效应，Cd2+可使CQDs/AuNCs的荧光猝灭，本发明公开了CQDs/AuNCs比率荧光探针在Cd2+检测中的应用。抗坏血酸可使被Cd2+猝灭的CQDs/AuNCs荧光恢复，基于此该比率荧光探针还可用于AA的检测。本发明的比率荧光探针对Cd2+的检测下限为32.5nM，对AA的检测下限低至0.105μM，在镉离子和抗坏血酸检测中具有应用价值。
【专利说明】
一种镉离子和抗坏血酸检测用的碳量子点/金团簇比率荧光 探针
技术领域
[0001] 本发明属于荧光传感技术领域，具体涉及一种镉离子和抗坏血酸检测用的碳量子 点/金团簇比率荧光探针及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 比率型荧光探针具有主荧光团和参比发色团，两个发射峰分开，其荧光强度比可 以提供内在修正环境的干扰以及排除激发光强度的波动，提高了定量分析的精确度，突破 了基于单一荧光强度的探针易受检测底物的影响、光漂白等缺点，同时避免了易受到探针 浓度、极性、环境pH等因素的干扰，解决了产生假阳性后果的困境，在近年受到极大关注。
[0003] 镉(Cadmium)是一种重金属，广泛应用于工业生产，人体摄入被镉污染的食物会导 致人体慢性中毒，因此镉离子的识别与检测对生物化学、环境科学以及生命医学都有着重 大的现实意义。Taki等以Ν,Μ-二-(2-吡啶甲基）乙二胺(DPEA)骨架为配体的Cd 2+焚光比率 探针CadMQ，该探针在356nm有强吸收带，CadMQ的6个氮原子与Cd2+配位后在333nm出现新的 吸收带并随Cd 2+浓度增加而线性增强，对应356nm荧光强度随之减弱，根据CadMQ的激发光谱 在333、356nm处的荧光强度比值计算Cd 2+含量，线性检测范围40~660pM(Taki Μ等Journal of the American Chemical Society,2008,130(38): 12564-12565·)。郭子建等设计合成 了基于ICT荧光增强模式的Cd2+比率探针DBITA，荧光团为5-二甲氨基-2-(2-吡啶基)-苯并 咪唑（DBI)，其吡啶上的氮原子与分子中的DPA共同构成类似于DPEA的受体结构，DBITA在 362nm和393nm有两个激发带，其发射峰主峰对应波长分别为493nm和534nm，且随着Cd 2+浓度 增加对应荧光强度分别减弱和增强，I587/I493的比值在0.57~4.16范围内与Cd2+浓度呈线性 关系，检测下限低至0 · 3pM(Liu Z等，Chemical Communications ,2010,46(33) :6138-6140·)〇
[0004] 抗坏血酸(Ascorbic acid,AA)是人体必需的维生素，对维持人体正常生理机能起 着至关重要的作用，是生命体中重要的抗氧化剂、辅酶因子及神经传递素相关酶的组成成 分。张立佩等建立了基于量子点的荧光"开关"探针检测AA的新方法，高荧光CdTe量子点与 Mn2+间发生电子转移而产生焚光碎灭，加入AA后量子点焚光恢复，且焚光恢复程度与AA的浓 度线性相关，线性检测范围为0.25~16μΜ，检出限为36nM(张立佩等，高等学校化学学报， 2011,32(3):688-693.)。陈晓英等构建了用于人尿液中AA测定的关开型荧光探针，AA可恢 复高锰酸钾修饰的硒化镉量子点(CdSe-GSH QDs)荧光，线性检测范围为0.12~7.5mM，检出 限为0.06μΜ(陈晓英等，科学技术与工程，2011，11 (21): 4969-4971.)。
[0005] 尽管取得这些突破，但上述的荧光团主要是有机染料，易光漂白且制备过程复杂。 综上所述，通过选择适宜的荧光团和参比发色团，设计新型有效的比率荧光探针，建立能够 简便、精确地检测ΑΑ的方法具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 为解决现有的镉离子和抗坏血酸检测用的比率荧光探针成本高、发光稳定性弱等 问题，本发明提供了一种成本低、发光稳定、选择性和灵敏度高、可再生循环利用的镉离子 和抗坏血酸检测用的碳量子点/金团簇比率荧光探针。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] -种镉离子和抗坏血酸检测用的碳量子点/金团簇比率荧光探针的制备方法，通 过将发蓝光的碳量子点(CQDs)和发红光的金纳米团簇(AuNCs)复合形成CQDs/AuNCs纳米复 合物，具体步骤如下：
[0009] 将丙氨酸和组氨酸于150°C~250°C下水热反应6~24h，反应结束后透析，旋蒸除 去溶剂后得到CQDs;再将CQDs超声分散到含氨水的无水乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅 烷(APTES)，室温剧烈震荡，离心得到APTES修饰的CQDs;将11-巯基^^一烷酸(MUA)包覆的金 纳米团簇(AuNCs)分散到HEPES缓冲液中，加入EDC/NHS(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺）溶液，剧烈搅拌，再加入APTES修饰的CQDs，室温搅拌，离 心，得到CQDs/AuNCs纳米复合物，即碳量子点/金团簇比率荧光探针。
[0010]本发明中所述的1-巯基十一烷酸(MUA)包覆的AuNCs按照现有常规方法制备，可参 考文南犬【Chang H C, et al .Facile preparation of high-quantum-yield gold nanoclusters :application to probing mercuric ions and biothiols[J]. ACS applied materials&interfaces,2014,6(21): 18824-18831 ·】制备。
[0011] 优选地，所述的水热反应温度为200°C，反应时间为6~12h。
[0012]所述的丙氨酸与组氨酸的摩尔比为8~16:1，优选为10:1。
[0013]所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的用量为每毫升CQDs的无水乙醇分散液中 加入10~30yL。
[0014] 所述的HEPES缓冲液的浓度为1 OmM，pH为7.0。
[00?5] 所述的离心转速为12000rpm，离心时间为20min。
[0016] 所述的AuNCs和CQDs的质量比为4~1:1，优选为2:1。
[0017] 所述的EDC和NHS的摩尔比为1:2~4,优选为1:3。
[0018] 在另一方面，本发明还提供上述制备方法得到的碳量子点/金纳米团簇比率荧光 探针在Cd2+检测中的应用，具体检测方法为:在CQDs/AuNCs纳米复合物溶液中加入含Cd 2+的 待测液，在最佳激发波长340nm激发下记录350~672nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强 度比值1624/1438,根据荧光强度比值I624/I438与Cd 2+浓度的线性关系，得到待测液中Cd2+的浓 度。
[0019] 进一步地，本发明还提供上述制备方法得到的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探 针在AA检测中的应用，具体检测方法为:在CQDs/AuNCs纳米复合物溶液中加入Cd 2+溶液得到 Cd2+和CQDs/AuNCs复合物(CQDs/AuNC/Cd2+)，然后加入含抗坏血酸的待测液，在最佳激发波 长340nm激发下记录350~672nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值1 624/1438 ,根据 荧光强度比值1624/1438与抗坏血酸浓度的线性关系，得到待测液中抗坏血酸的浓度。
[0020] 上述的Cd2+和CQDs/AuNCs复合物中Cd2+的含量能够猝灭CQDs/AuNCs的荧光为基 本，在本发明的一个具体实施例中，Cd2+和CQDs/AuNCs复合物中，每毫克CQDs/AuNCs中加入 0·75μπιο1 的 Cd2+。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1)本发明中以丙氨酸与组氨酸作为 氨源，制备CQDs，CQDs发蓝光，AuNCs发红光，双波长荧光检测，构成比率荧光探针，可排除光 漂白、探针浓度、环境条件(温度、PH、极性）、光稳定性等因素的干扰，检测准确度更高；（2) Cd2+使AuNCs荧光猝灭，AA使AuNCs荧光恢复，开关型荧光探针可再生循环利用，绿色经济； (3)所制备的CQDs/AuNCs检测Cd 2+和AA，具有较高选择性和灵敏度，并能应用于实际湖水中 Cd2+和人血清中AA的检测，该比率荧光探针对Cd2+的检测下限为32.5nM，对AA的检测下限低 至0.105μΜ，显著低于现有的AA检测荧光探针的检测限。
【附图说明】
[0022]图1为实施例1步骤4制备的CQDs/AuNCs的高分辨ΤΕΜ图。
[0023]图2为实施例1步骤4制备的CQDs/AuNCs的X射线光电子能谱，其中（a)是全谱图， (b)是碳元素的分峰图，（c)是氮元素的分峰图，（d)是金元素的分峰图。
[0024]图3为红外光谱图，其中(a)为实施例1步骤1制备的CQDs的红外光谱图，（b)是实施 例1步骤2制备的氨基修饰的CQDs，（C)是实施例1步骤3制备的MUA修饰的AuNCs，（d)是实施 例1步骤4制备的CQDs/AuNCs。
[0025]图4为实施例1步骤2制备的氨基化CQDs、实施例1步骤3制备的MUA修饰的AuNCs、实 施例1步骤4制备的CQDs/AuNCs的紫外吸收光谱图。
[0026]图5为实施例1步骤2制备的氨基化CQDs、实施例1步骤3制备的MUA修饰的AuNCs、实 施例1步骤4制备的CQDs/AuNCs的荧光发射光谱图。
[0027]图6为实施例1制备的CQDs/AuNCs的荧光衰减曲线图。
[0028]图7为实施例1制备的CQDs/AuNCs对Cd2+的荧光检测结果图，（a)为不同浓度Cd2+下 的N-CQDs荧光发射光谱，（b)为实施例1制备的CQDs/AuNCs在波长624nm和438nm处荧光强度 比值(1624/1438 )与Cd2+浓度的关系图。
[0029]图8为实施例1制备的CQDs/AuNCs对Cd2+检测的选择性结果图。
[0030] 图9为实施例1制备的CQDs/AuNCs与Cd2+的混合体系对AA的荧光检测结果图，（a)为 不同浓度AA下的荧光发射光谱，（b)为CQDs/AuNCs在波长624nm和438nm处荧光强度比值 ( 1624/1438)与AA浓度的关系图。
[0031] 图10为实施例1制备的CQDs/AuNCs对AA检测的选择性结果图。
[0032]图11为本发明的CQDs/AuNCs制备及检测应用的机理图。
【具体实施方式】
[0033]为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合附图和具体步骤对本发明所述 的技术方案做进一步的说明。
[0034] 实施例1
[0035] -种制备本发明的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针的方法，包括如下步骤：
[0036] 步骤1、碳量子点的制备:将2.673g丙氨酸和0.466g组氨酸超声溶解于30.0 mL超纯 水中，再将混合液转入聚四氟乙烯高压反应釜(型号为50.OmL)中，置于鼓风式加热烘箱中， 200°C下水热反应6h，反应结束后，自然冷却至室温，得到深绿色透明液体，装入截留分子量 1000的透析袋中于双蒸水中透析24h除去未反应的前体，45°C旋转蒸发除去溶剂，制备得到 CQDs；
[0037]步骤2、氨基化碳量子点的制备:将5mg步骤1获得的CQDs和20yL氨水(28wt % )分散 至Ijl .5mL无水乙醇中，超声15min后加入10yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，超声30min， 室温下于祸旋混合器上剧烈震荡3h，置于高速离心机离心20min，转速为12000rpm，弃上清 得到APTES修饰的CQDs。取l.Omg氨基化碳量子点扩散到lmL HEPES缓冲液中（10mM，pH 7.0)，超声均匀待用；
[0038]步骤3、金纳米团簇(AuNCs)的制备：参考文献方法，将0.1092g 11-巯基^^一烷酸 (MUA)溶解于50mL 15mM NaOH中，将边搅拌边逐滴加入25mL 5mM氯金酸(HAuCl4)，剧烈搅拌 使其混合均匀，再缓慢滴加30μπιο 1 NaOH直至上述混合溶液澄清，新鲜配制2mM NaBH4溶液： 将0.0076g硼氢化钠(NaBH4)超声溶解于100mL超纯水中，取6.25mL逐滴加入上述混合液，室 温下磁力搅拌一天，装入截留分子量1000的透析袋中于双蒸水中透析24h除去未反应的前 体，真空干燥得到MUA修饰的金纳米团簇(AuNCs)。取2 . Omg MUA修饰的AuNCs扩散到1 mL HEPES缓冲液中（1 OmM，pH 7.0)，超声均匀待用；
[0039] 步骤4、碳量子点/金纳米团簇（CQDs/AuNCs)的制备：取400yL步骤（3)制备的 2.0mg/mL MUA修饰的AuNCs溶液扩散到1.5mL HEPES缓冲液中，超声均匀。新鲜配制含有 10mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的水溶液，取l〇〇yL EDC/NHS混合溶液加入上述1.5mL AuNCs溶液，磁力搅拌15min。再加入 400yL步骤（2)制备的1.0mg/mL APTES修饰的CQDs，室温搅拌12h。置于高速离心机离心 20min，转速为12000rpm，弃上清出去未反应前体，得到CQDs/AuNCs纳米复合物。
[0040] 实施例2
[0041] -种制备本发明的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针的方法，包括如下步骤：
[0042] 步骤1、碳量子点的制备:将2.138g丙氨酸和0.466g组氨酸超声溶解于30.0 mL超纯 水中，其他条件与实施例1的步骤1相同；
[0043] 步骤2、氨基化碳量子点的制备：同实施例1步骤2;
[0044] 步骤3、金纳米团簇(AuNCs)的制备：同实施例1步骤3;
[0045] 步骤4、碳量子点/金纳米团簇（CQDs/AuNCs)的制备：取800yL步骤（3)制备的 2.0mg/mL MUA修饰的AuNCs溶液扩散到1.5mL HEPES缓冲液中，超声均匀。新鲜配制含有 10mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和20mM N-羟基琥珀酰亚胺的水 溶液，取l〇〇yL EDC/NHS混合溶液加入上述1.5mL AuNCs溶液，磁力搅拌15min。再加入400yL 步骤(2)制备的1.0mg/mL APTES修饰的CQDs，室温搅拌12h。置于高速离心机离心20min，转 速为12000rpm，弃上清除去未反应前体，得到CQDs/AuNCs纳米复合物。
[0046] 实施例3
[0047] -种制备本发明的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针的方法，包括如下步骤：
[0048] 步骤1、碳量子点的制备:将4.2763g丙氨酸和0.466g组氨酸超声溶解于30.0 mL超 纯水中，其他条件与实施例1的步骤1相同；
[0049]步骤2、氨基化碳量子点的制备：同实施例1步骤2;
[0050 ] 步骤3、金纳米团簇(AuNCs)的制备：同实施例1步骤3;
[0051 ] 步骤4、碳量子点/金纳米团簇（CQDs/AuNCs)的制备：取200yL步骤（3)制备的 2.0mg/mL MUA修饰的AuNCs溶液扩散到1.5mL HEPES缓冲液中，超声均匀。新鲜配制含有 10mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和40mM N-羟基琥珀酰亚胺的水 溶液，取l〇〇yL EDC/NHS混合溶液加入上述1.5mL AuNCs溶液，磁力搅拌15min。再加入400yL 步骤(2)制备的1.0mg/mL APTES修饰的CQDs，室温搅拌12h。置于高速离心机离心20min，转 速为12000rpm，弃上清除去未反应前体，得到CQDs/AuNCs纳米复合物。
[0052] 实施例4
[0053]对实施例1制备的碳量子点/金纳米团簇(CQDs/AuNCs)纳米复合物进行表征分析， 具体步骤包括：
[0054] 1、透射电镜观察
[0055] 所制备的CQDs/AuNCs的形貌及尺寸是通过透射电镜(TEM，Philips TECNAI-12)进 行测试，电压为300kV。做电镜之前，先将10yL的样品滴加到200目的超薄碳支持膜铜网上， 置于室温下蒸发溶剂水，即可进行电镜操作，结果参见图1。如图1所示，CQDs/AuNCs呈均匀 的哑铃状，平均尺寸为5nm。
[0056] 2、X射线光电子能谱
[0057]所制备的CQDs/AuNCs的晶体结构和表面官能团是通过X射线光电子能谱(XPS，美 国Thermo Fisher Scientific公司）进行测试，结果如图2所示。从a图可以看出CQDs/AuNCs 含C、0、N、Au等元素，含量分别为60 · 5%、24 · 9%、6 · 2%和5 · 7%。由b图可知CQDs/AuNCs的Cis 主峰可分为 283.6eV、285. OeV、286.6eV、287.2eV 等 4 个峰，分别对应官能团 C-C、C-N、C-〇、C = N/C = 0, ；c图的Nis分峰分别对应C-N-C、N-H;d图中分峰86.7eV、82.8eV，分别对应Au 4f5/2、Au 4f7/2，其中Au 4f7/2又可细分为82·6eV、83· 2eV，分别对应Au(0)和Au(I)。
[0058] 3、红外光谱
[0059] 所制备的CQDs、AuNCs和CQDs/AuNCs的表面基团和结构组成是通过TENS0R27型FT-IR光谱仪进行测试，制样采用KBr压片法，结果如图3所示。由图可知，所制备的CQDs表面含 有〇-!1、(：-〇!1、〇 = 〇、(：-!1、和(：-〇官能团，所制备的氨基修饰的〇0〇8表面除上述官能团，增加了 N-H、C-N官能团，所制备的MUA修饰的AuNCs表面含有0-H、C = 0、C-H、和C-0官能团，所制备的 CQDs/AuNCs相比CQDs和AuNCs，在1250cm-1处增加一个峰，进一步证明CQDs和AuNCs之间通过 酰胺键偶联。
[0060] 4、紫外光谱和荧光光谱
[00611 所制备的CQDs、AuNCs和CQDs/AuNCs进行紫外光谱测试，所用仪器为紫外可见分光 光度仪(UV-3600,岛津，日本），结果如图4所示。CQDs在330nm有强吸收，该吸收峰是由于 CQDs表面的C = 0发生的n-3i*跃迀所致;CQDs在236nm有一个弱吸收峰，该吸收峰是由于CQDs 结构中芳环的C = c发生的3T-JT*跃迀所致。AuNCs在235nm有强吸收，在380nm有一个弱吸收 峰。CQDs/AuNCs除了与单独的CQDs和AuNCs有相似的吸收峰外，在630nm处有一个额外的吸 收峰。
[0062] 所制备的CQDs、AuNCs和CQDs/AuNCs的荧光发射光谱是通过荧光分光光度计(爱丁 堡分析仪器，FLS920)进行测试，结果如图5所示。优选地，最佳激发波长为340nm，CQDs对应 发射主峰波长为438nm，AuNCs对应发射主峰波长为672nm，CQDs/AuNCs有两个发射峰:438nm 和672nm。
[0063] CQDs/AuNCs荧光寿命是根据时间相关单光子技术，通过组合荧光寿命仪(爱丁堡 分析仪器，FLS920)进行测量，其结果如图6所示，CQDs/AuNCs的平均荧光寿命为9.25ns。
[0064] 实施例5
[0065] 本发明制备的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针，基于静电作用和金属-配位的 协同作用，其荧光可被Cd2+猝灭，具体表现为AuNCs对应的624nm处的荧光发射峰强度减弱， 而CQDs对应的438nm处荧光发射峰强度几乎没有变化，使得猝灭过程如图11所示。
[0066] 本发明制备的一种碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针定量检测Cd2+的应用，具体 检测方法如下：
[0067] 取50 .Omg实施例1步骤4制备的CQDs/AuNCs纳米复合物溶于10mL HEPES缓冲液中 (10mM，pH 7.0)，超声均匀配制5mg/mL CQDs/AuNCs溶液。各取200yL 5mg/mL CQDs/AuNCs溶 液于13个5 · OmL离心管中，加入Cd2+的HEPES溶液（10mM，pH 7 · 0)，分别形成不同Cd2+浓度(Ομ Μ、1μΜ、3μΜ、6μΜ、ΙΟμΜ、15μΜ、20μΜ、30μΜ、60μΜ、80μΜ、120μΜ、180μΜ、250μΜ)，总体积同为 3.〇111]^的0(?8/^111^8与0(12+的混合溶液;混勾1〇111；[11后，在最佳激发波长340111]1激发下记录350 ~672nm范围内各样品的荧光发射光谱;所有操作都在室温下进行。
[0068]结果参见图7，如a图所示，随着Cd2+浓度的增加，所制备的CQDs/AuNCs在624nm处荧 光发射峰强度随之减小，在438nm处荧光发射峰强度几乎不变，使得其荧光强度比值1624/ 1438逐渐减小，如图b所示。b图中的插图表明Cd 2+的浓度在0.04~15μΜ范围内与1624/1438成线 性关系，检测限为32.5ηΜ。
[0069] 世界卫生组织（WHO)规定瓶装水中镉的最大浓度为40ηΜ，本发明制备的CQDs/ AuNCs检测Cd2+的检测限更低，在检测瓶装水中Cd2+是否超标具有实际应用价值。
[0070] 实施例6
[0071] 本发明制备的一种碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针对Cd2+检测的选择性，具体 检验方法如下：
[0072] 取50 .Omg实施例1步骤4制备的CQDs/AuNCs纳米复合物溶于10mL HEPES缓冲液中 (10mM，pH 7.0)，超声均匀配制5mg/mL CQDs/AuNCs溶液。各取200yL 5mg/mL CQDs/AuNCs溶 液于13个5. OmL离心管中，分别加入250μΜ的不同其他金属离子(空白、K+、Na+、Cu2+、Mg2+、Ca 2 +、2112+、？63+、？132+、附2+^8 +、(：〇2+和血2+)溶液，保持体积同为3.01^，溶剂为在101111?!17.0的 HEPES缓冲液;混匀lOmin后，在最佳激发波长340nm激发下记录350~672nm范围内各样品的 荧光发射光谱，计算1624/1438 ;在上述离子存在的情况下，分别加入250μΜ Cd2 +溶液，混匀 lOmin后，在最佳激发波长340nm激发下记录350~672nm范围内各样品的焚光发射光谱，计 算1624/1438。所有操作都在室温下进行。
[0073]结果如图8所示。图中的黑色柱表明其他干扰金属离子的加入并没有显著抑制 CQDs/AuNCs的荧光，灰色柱表明在含有干扰金属离子的CQDs/AuNCs溶液中加入Cd2+后，1624/ 1438显著下降，这表明可以忽略上述金属离子在检测Cd 2+时的影响，同时也说明了所制备的 CQDs/AuNCs比率荧光探针对Cd2+的检测具有很高的专一性。
[0074] 实施例7
[0075] 本发明制备的一种碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针对实际湖水中Cd2+的检测， 具体检验方法如下：
[0076] 检测方法按照实例5所述的方法，除了检测前对湖水的预处理:首先将取样的湖水 用0.22μπι的膜过滤，用滤液配制不同浓度的Cd 2+溶液，加在实例5所述的CQDs/AuNCs中反应 lOmin，然后测定焚光强度。
[0077]如表1所示，通过CQDs/AuNCs比率荧光探针检测出的Cd2+浓度和之前加入的标准值 有高度的统一性，证明CQDs/AuNCs在上述传感平台中有一定的实用性。
[0078] 表1 ·湖水中Cd2+的检测
实施例8
[0080] 在Cd2+存在下，抗坏血酸（AA)会在60°C下缓慢分解，形成镉草酸盐聚合物（Cd (C2〇4) · 3H20)，基于此竞争机制，AA会使实例3中被Cd2+猝灭的CQDs/AuNCs比率荧光探针的 荧光恢复，如图11所示。
[0081] 本发明制备的一种碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针定量检测抗坏血酸(AA)的 应用，具体检测方法如下：
[0082] 按照实例3所述的方法，分别取200yL 5mg/mL CQDs/AuNCs溶液于13个5.0mL离心 管中，加入250μΜ Cd2+溶液（体积为3.0mL，溶剂为在10mM pH 7.0的HEPES缓冲液），混匀 lOmin后得到Cd2+和CQDs/AuNCs复合物(CQDs/AuNC/Cd2+)。分别加入不同浓度抗坏血酸(0μ 1、2以]?、54]\1、84]\1、114]\1、154]\1、254]\1、5(^]\1、754]\1、12(^]\1、16(^]\1、20(^]\1、25(^]\1，溶剂为1〇111]\1?!1 7 · 0的HEPES缓冲液），反应20min后，在最佳激发波长340nm激发下记录350~672nm范围内各 样品的荧光发射光谱。
[0083] 结果见图9。如a图所示，随着AA浓度的增加，所制备的CQDs/AuNC/Cd2+在624nm处荧 光发射峰强度增强，并逐渐恢复到被Cd2+猝灭前的CQDs/AuNC的荧光强度，在438nm处荧光发 射峰强度几乎不变，使得其荧光强度比值1624/1438也逐渐恢复，如图b所示。b图中的插图表 明AA的浓度在0.15~15μΜ范围内与1624/1438成线性关系，检测限为0.105μΜ，比近年来所公 布的其他荧光探针检测ΑΑ的线性范围和检测限都低。
[0084] 实施例9
[0085] 本发明制备的一种碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针对ΑΑ检测的选择性，具体 检验方法如下：
[0086] 按照实例6所述的方法，分别取200yL 5mg/mL CQDs/AuNCs溶液于10个5.0mL离心 管中，加入250μΜ Cd2+溶液（体积为3.0mL，溶剂为在10mM pH 7.0的HEPES缓冲液），混匀 1 Omin后得到Cd2+和CQDs/AuNCs复合物(CQDs/AuNC/Cd2+)。分别加入200μΜ其他干扰生物分 子(空白、葡萄糖、多巴胺、尿素、谷胱甘肽、柠檬酸、维他命Β2,维他命Β6、天冬氨酸和叶酸， 溶剂为10mM pH 7.0的HEPES缓冲液），反应20min后，在最佳激发波长340nm激发下记录350 ~672nm范围内各样品的荧光发射光谱。
[0087]结果如图10所示。图中的黑色柱表明其他干扰生物分子的加入并没有恢复CQDs/ AuNCs的荧光，灰色柱表明在含有干扰生物分子的CQDs/AuNCs/Cd2+溶液体系中加入AA后， 1624/1438显著增加，这表明可以忽略上述干扰生物分子在检测AA时的影响，同时也说明了所 制备的CQDs/AuNCs比率荧光探针对AA的检测具有很高的专一性。
[0088] 实施例10
[0089] 本发明制备的一种碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针应用于临床检测，可检测 人体血清中的抗坏血酸，具体检测方法如下：
[0090] 检测方法按照实例6所述的方法，除了检测前样品的处理:首先将人血浆进行离心 lOmin，转速为7000rpm，取上层血清，再用不同浓度的AA预处理血清样品，各取10yL加在实 例6所述的CQDs/AuNCs/Cd 2+溶液体系中反应lOmin，然后测定荧光强度。
[0091] 表2.血清中AA的检测
[0094]如表2所示，通过CQDs/AuNCs比率荧光探针检测出的AA浓度和之前加入的标准值 有高度的统一性，证明CQDs/AuNCs在上述传感平台中有一定的实用性。
【主权项】
1. 一种镉离子和抗坏血酸检测用的碳量子点/金团簇比率荧光探针的制备方法，其特 征在于，具体步骤如下:将丙氨酸和组氨酸于150 °C~250 °C下水热反应6~24h，反应结束后 透析，旋蒸除去溶剂后得到CQDs;再将CQDs超声分散到含氨水的无水乙醇中，加入3-氨丙基 三乙氧基硅烷，室温剧烈震荡，离心得到3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的CQDs;将11-巯基十 一烷酸包覆的金纳米团簇AuNCs分散到HEPES缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，剧烈搅拌，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰 的CQDs，室温搅拌，离心，得到CQDs/AuNCs纳米复合物，即碳量子点/金团簇比率荧光探针。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的水热反应温度为200°C，反应时 间为6~12h，所述的HEPES缓冲液的浓度为10mM，pH为7.0,所述的离心转速为12000rpm，离 心时间为20min，所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量为每毫升CQDs的无水乙醇分散液中 加入10~30yL。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的丙氨酸与组氨酸的摩尔比为8 ~16:1，所述的AuNCs和CQDs的质量比为4~1:1，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2~4。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的丙氨酸与组氨酸的摩尔比为 10:1，所述的AuNCs和CQDs的质量比为2:1，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1: 3。5. 根据权利要求1至4任一所述的制备方法得到的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探 针。6. 根据权利要求1至4任一所述的制备方法得到的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针 在Cd2+检测中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体检测方法为:在CQDs/AuNCs纳米复合 物溶液中加入含Cd2+的待测液，在最佳激发波长340nm激发下记录350~672nm范围内的荧光 发射光谱，计算荧光强度比值1624/1438,根据荧光强度比值1624/1438与Cd 2+浓度的线性关系， 得到待测液中Cd2+的浓度。8. 根据权利要求1至4任一所述的制备方法得到的碳量子点/金纳米团簇比率荧光探针 在抗坏血酸检测中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，具体检测方法为:在CQDs/AuNCs纳米复合 物溶液中加入Cd2+溶液得到Cd 2+和CQDs/AuNCs复合物，然后加入含抗坏血酸的待测液，在最 佳激发波长340nm激发下记录350~672nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值1 624/ 1438 ,根据焚光强度比值1624/1438与抗坏血酸浓度的线性关系，得到待测液中抗坏血酸的浓 度。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的Cd2+和CQDs/AuNCs复合物中，每毫 克 CQDs/AuNCs 中加入 0 · 75ymol 的 Cd2+。
【文档编号】G01N21/64GK106047342SQ201610463716
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】单丹, 朱容慧, 牛文军, 华艳, 李怡萱, 宗丽萍
【申请人】南京理工大学