Gd³⁺诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法及应用

Gd³⁺诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法及应用
【专利摘要】本发明提供一种Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法及应用，所述方法包括：金纳米团簇的制备步骤：以手性L型谷胱甘肽作为巯基配体制备的金纳米团簇，将金纳米团簇溶于去离子水中，形成溶液A；三价钆离子Gd3+溶液制备步骤：六水氯化钆溶于去离子水中，配成溶液B，超声后备用；Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤：将溶液B缓慢滴加入溶液A中，诱导其中金纳米团簇自组装成金纳米颗粒。本发明方法简单，材料合成成本低，反应条件简单，易于操作，制备得到的金纳米颗粒具有增强的荧光成像以及CT成像效果，螯合了Gd3+可以作为肿瘤核磁成像造影剂。实验结果表明制备得到的金纳米颗粒能很好应用在肿瘤的多模态成像领域。
【专利说明】
Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及无机纳米材料技术领域，具体地，涉及Gd3+诱导的金纳米团簇自组装成金纳米颗粒方法，以及三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇自组装产物用于肿瘤的多模态成像方法。【背景技术】
[0002]目前，生活节奏的加快以及环境的恶化，癌症已经成为威胁人类健康的主要杀手。 其中肺癌的患病人数居恶性肿瘤患病人数之首。寻找有效的肿瘤诊断方法对捍卫人类生命健康安全具有重大的意义。近年来，光学成像(Optical Imaging，01)、磁共振成像 (Magnetic Resonance Imaging，MRI)、正电子发身才断层成像(Positron Emiss1n Tomography，PET)、单电子发射计算机断层成像(Single Photon Emiss1n CT，SPECT)和超声成像(ultrasonography，USG)等在肿瘤的临床诊断上得到了广泛的应用。为了充分发挥医学造影剂在癌症诊断中的优势，开发高效、灵敏的新型造影剂势在必行。随着纳米技术的发展，各种多功能纳米探针已经开始用于肿瘤医学诊断的研究中。金纳米团簇在尺寸上介于分子与纳米晶体之间，具有高的生物相容性，光学性能稳定，合成方法简单，并且表面富含功能基团易于修饰，在光电子学、化合物检测、生物传感以及纳米生物医药方面的应用有广泛的研究。但是单一的金纳米团簇只能用于肿瘤的CT成像和荧光成像，且其在CT成像以及荧光成像应用中的效果仍需要提升。
[0003]研究表明通过一定的方法将小粒径的金纳米团簇可以组装成高度有序的大粒径的金纳米颗粒，从而增强小粒径纳米颗粒原有的性质或者赋予其新的性质。(Qiao et al.， Sc1.Rep.2014,4,3848)。据报道，水溶液中阳离子Zn2+或者Cd2+通过离子间相互作用力可以诱导带有负电的金纳米团簇组装成粒径大小在l〇〇nm左右的金纳米颗粒，从而增强金纳米团簇的荧光效果。但是该方法只是停留在改变金纳米团簇的性质方面，并未涉及组装后的金纳米颗粒在肿瘤诊断中潜在的应用价值。
[0004]目前，小分子钆配合物造影如二亚乙基三胺五乙酸钆螯合物(Gd-DTPA)等是临床上最常用的核磁共振的显影增强剂。随着纳米技术的进步，越来越多的纳米材料被用于核磁共振成像造影剂。但是，目前多数纳米材料都是依赖共价偶联螯合剂二乙基三胺五乙酸之类，再螯合乳离子(Gd3+)的方法用作T1加权的核磁共振成像。这些方法不仅合成方法繁琐而且成本高。这意味着，如果能通过简单，高效，低成本的方法将乳离子(Gd3+)螯合到纳米材料中就可以提尚纳米材料造影剂的临床应用潜能。
[0005]经检索，陈潜等2013年8月2日发表在期刊《东华大学》上的论文“多功能化树状大分子包裹的金纳米颗粒用于CT/MRI靶向诊断肿瘤的研究”，论文以聚乙二醇(PEG)功能化树状大分子为平台内部包裹CT造影剂金纳米颗粒，表面修饰T1MRI造影剂钆和靶向试剂分子叶酸(FA)或多肽Arg-Gly-Asp(RGD)，分别用于高叶酸受体表达的人口腔上皮样癌株(KB细胞)或高整合素avK表达的恶性胶质瘤(U87MG细胞)的CT/MRI双模态成像诊断。
[0006]上述文献是基于树状大分子PAMAM来制备树状大分子稳定的金纳米颗粒的方法。同时，利用化学键在树状大分子上接DOTA作为螯合剂来螯合钆离子。该方法复杂步骤多，金纳米颗粒和钆离子直接没有相互作用。且虽能用CT/MRI双模态成像诊断，但没有荧光成像的功能。
[0007]检索结果表明:三价钆离子(Gd3+)诱导的金纳米团簇自组装用于肿瘤的多模态成像方法，尚未见报道。
【发明内容】

[0008]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法及应用，采用快速，高效，简易的方法，利用离子间相互作用的原理将钆离子(Gd3+)螯合到金纳米团簇上的同时将金纳米团簇诱导成大的金纳米颗粒，充分发挥钆离子(Gd3+)以及金纳米团簇的优良性质。
[0009]根据本发明的第一方面，提供一种Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，包括如下步骤:
[0010]金纳米团簇的制备步骤:以手性L型谷胱甘肽作为巯基配体制备的金纳米团簇，该金纳米团簇粒径均一、光学性质稳定、水溶性好，将金纳米团簇溶于去离子水中，形成溶液 A；
[0011]三价钆离子Gd3+溶液制备步骤:将三价钆离子Gd3+溶于去离子水中，配成溶液B，超声后备用；
[0012]三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤:将溶液B缓慢滴加入溶液A中，诱导其中金纳米团簇自组装成金纳米颗粒。[0〇13]优选地，所述金纳米团簇的制备(Au NCs)步骤中:金纳米团簇为手性谷胱甘肽(L-glutath1ne，L-GSH)作为疏基配体制备的金纳米团簇，其谷胱甘肽和金原子的摩尔比例为 18:22，金纳米团簇溶于6.2〈pH〈7.0的去离子水中。[〇〇14]优选地，所述三价钆离子Gd3+溶液制备步骤中:三价钆离子Gd3+来自六水氯化钆 (GdCl3 ? 6H20)，三价钆离子Gd3+溶液为新鲜配置的溶液。
[0015]优选地，所述三价钆离子Gd3+溶液制备步骤中:三价钆离子Gd3+溶液溶于6.2〈pH〈 7.0的去离子水中，100W超声2-3min后备用。
[0016]本发明中pH值的大小对钆离子以及金纳米团簇之间的离子相互作用影响很大，间接的影响金纳米团簇的自组装。[0〇17]优选地，所述三价IL离子(Gd3+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤中:反应的三价IL 离子(Gd3+)和金纳米团簇的摩尔比1.1:1-1.5:1，更优选为1.26:1。两者的摩尔比低于1.1:1 则钆离子的量不足金纳米团簇不能组装成分散的颗粒，比例高于1.5:1则钆离子的量太高， 容易造成团聚。
[0018]优选地，所述三价IL离子(Gd3+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤中:反应的金纳米团簇和三价钆离子(Gd3+)的体积比为4:1。
[0019]本发明中金纳米团簇溶液浓度可以为1.25mg/mL，钆离子的浓度根据加入的金的总量来计算。
[0020]优选地，所述三价钆离子(Gd3+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤中:反应的Gd3+缓慢滴加到金纳米团簇的溶液中，如果滴加太迅速可能形成的颗粒很不均匀，而且容易造成团聚和沉淀。滴加速度可以选择350-450yL/min。[〇〇21]优选地，所述三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤中:反应条件为: 1400-1600rpm/min 快速涡旋 30s-lmin，反应温度为 25-35°C，1200-1400rpm/min 搅拌 3h ? 6h〇
[0022]根据本发明的第二方面，提供一种上述制备得到的组装后金纳米颗粒的应用，即: 组装后金纳米颗粒作为肿瘤的多模态成像造影剂。
[0023]具体的，先进行组装后金纳米颗粒(GNCNs)的纯化，然后将其用于肿瘤的多模态成像。[0〇24] 优选地，所述金纳米颗粒(GNCNs)的纯化，是指:采用葡葡聚糖凝胶层析Sephadex G-150以及去离子水作为平衡液来纯化制备得到的金纳米颗粒。
[0025]本发明利用钆离子来诱导金纳米团簇的自组装变成大的金纳米颗粒，且无需用到螯合剂来螯合钆离子，整个方法简单，没有复杂程序，生产的金纳米颗粒能用于肿瘤的多模态成像造影剂(包括荧光成像)。
[0026]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0027](1)本发明反应条件简单，步骤简单，易于操作，具有产业化合成的前景；
[0028](2)本发明不需要共价结合多余的螯合剂来螯合Gd3+，降低了合成成本，减少了合成工艺步骤；
[0029](3)本发明合成的自组装金纳米颗粒分布均匀，充分发挥了金纳米团簇和Gd3+的性能优势，且具有较高的生物相容性、较高的X-射线衰减强度、T1弛豫时间和较好的CT成像、 MRI成像和荧光成像效果，可以用于肺癌肿瘤的多模态成像。【附图说明】
[0030]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显:
[0031]图1A-图1C分别是本发明一实施例制备金纳米颗粒的TEM图片、SEM图片以及高分辨TEM图片；
[0032]图2是本发明一实施例合成的金纳米颗粒的水动力粒径分布图片；[〇〇33]图3是STEM分析本发明一实施例合成的金纳米颗粒的组成元素；[〇〇34]图4是本发明一实施例制备的金纳米颗粒的X-射线衰减强度结果和T1弛豫时间:A 为本发明合成材料的X-射线衰减强度实验结果;B为本发明合成材料的核磁成像T1弛豫时间结果；
[0035]图5是本发明一实施例制备的金纳米颗粒的细胞MTT实验结果；
[0036]图6是本发明一实施例制备的金纳米颗粒的MRI成像图片；
[0037]图7是本发明一实施例制备的金纳米颗粒的CT成像图片；
[0038]图8是本发明一实施例制备的金纳米颗粒的荧光活体成像图片。【具体实施方式】[〇〇39]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0040] 实施例1[0041 ](1)金纳米团簇的制备:新鲜配置的HAuCl4溶液(8mM/mL)和GSH溶液(150mM/mL)加入到43.5mL冷的超纯水中，冰浴搅拌(200rpm/min)3min，形成了白色的Au(I)-SG不溶物。冷的四丁基溴化铵(TBAB)溶液(摩尔比:TBAB/Au = 9.3:1)加入上述混合物中剧烈搅拌5min后静置2h。1M HC1调整pH值到?3.0，继续冰浴12h，形成金纳米团簇。[〇〇42](2)金纳米团簇的纯化:离心除去不溶的Au(I)_SG复合物后超滤浓缩，加入NaCl和甲醇沉淀的到金纳米团簇，冷冻干燥后放4°C备用。
[0043]上述制备的金纳米团簇，在后续自组装步骤中，可以利用该金纳米团簇表面的羧基负电荷和钆的正电荷相互作用。当然，在其他实施例中也可以采用其他方法制备，只要是以手性L型谷胱甘肽作为巯基配体制备的金纳米团簇。
[0044]实施例2[〇〇45](1)三价6(13+的准备:六水氯化钆(6(1(:13*61120)溶于?11?6.5的去离子水中，按照所需的量配成终体积为〇.5mL的水溶液，100W超声2min后备用。
[0046](2)三价钆离子(Gd3+)诱导的金纳米团簇自组装:首先将实施例1中制备的金纳米团簇溶于pH?6 ? 5(6? 2〈pH〈7 ? 0)的去离子水中(2 ? 5mg，2mL)，随后新鲜配置的Gd3+(Gd3+离子和金纳米团簇的摩尔比为1.26:1)缓慢滴加(约400yL/min)入金纳米团簇的水溶液中， 1500rpm/min快速祸旋30s_lmin，随后在水浴锅中25_30°C加热，1300rpm/min搅拌3h?6h， 得到组装后金纳米颗粒。[〇〇47] 实施例3[〇〇48](1)三价Gd3+的准备:六水氯化钆(GdCl3 ? 6H20)溶于pH7.0的去离子水中，按照所需的量配成终体积为〇.5mL的水溶液，120W超声3min后备用。[〇〇49](2)三价钆离子(Gd3+)诱导的金纳米团簇自组装:首先将金纳米团簇溶于pH7.0的去离子水中(2.5mg，2mL)，随后新鲜配置的Gd3+(Gd3+离子和金纳米团簇的摩尔比为1.1:1) 缓慢滴加(约350yL/min)入金纳米团簇的水溶液中，1600rpm/min快速祸旋lmin，随后在水浴锅中25 °C加热，1400rpm/min搅拌6h，得到组装后金纳米颗粒。
[0050] 实施例4[0051 ]将实施例2、3中组装后金纳米颗粒(61'0^)的纯化:通过葡聚糖凝胶层析36?1^(161G-150来纯化GNCNs，用去离子水平衡层析柱。[〇〇52]细胞水平上的自组装纳米颗粒的生物相容性，A549细胞以合适密度铺于96孔板， 于37°C、5%C02培养12-24小时。换成100yL新鲜的含有不同浓度的GNCNs或roS(对照组)的完全培养基，37 °C培养24和48小时后加入MTT溶液，继续培养4h，去除培养基，加入DMS0，摇床振荡10_20min;在酶标仪下测试吸光值。该方法用于检测GNCNs的细胞毒性。
[0053]实施例5
[0054]将实施例2、3中组装后金纳米颗粒(GNCNs)的纯化:通过葡聚糖凝胶层析Sephadex G-150来纯化GNCNs，用去离子水平衡层析柱。[〇〇55]纯化后的组装金纳米颗粒(GNCNs)用于作为造影剂，进行肿瘤的多模态成像:将裸鼠分成三组每组三只，构建A549细胞皮下肿瘤模型，待肿瘤长至?200mm3。一组裸鼠尾静脉注射150yL的GNCNs的PBS溶液(Gd3+ = 5mM，[Au] = 1 lOmM)用于MRI成像;一组尾静脉注射相同量的GNCNs的量用于CT成像;一组瘤内注射20yL的GNCNs用于荧光成像。从图6可以看出注射 lOmin后GNCNs中的Gd3+已经向肿瘤部位富集并增强肿瘤部位的核磁成像信噪比，这种增强的荧光效果可以维持1个小时，说明GNCNs可以用于肿瘤的核磁诊断。从图7可以看出GNCNs 中的金可以增强肿瘤的CT成像效果可以用于肿瘤的CT诊断。图8表明瘤内注射GNCNs后肿瘤的近红外荧光成像效果非常明显并且可以维持24h以上。
[0056]多模态成像效果表明，Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装纳米颗粒，改变了传统的螯合造影剂的方法，拓宽了金纳米团簇在肿瘤诊断中的应用前景，在肿瘤的临床诊断中具有重要的潜在应用价值。[〇〇57]综上实施例，本发明使用透射电子显微镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、扫描透射电镜 (STEM)、动态光散射(DLS)测量等方法表征本发明制备的自组装纳米颗粒，细胞MTT实验检测材料的生物学相容性，同时用Micro-CT、磁共振仪以及小动物活体成像仪来检测自组装金纳米颗粒的小鼠活体肿瘤成像效果，具体检测结果分别如下:
[0058](l)TEM 以及 SEM 测量:
[0059]在水中合成的自组装金纳米颗粒的TEM图片以及SEM图片(参见图1)，表明形成的金纳米颗粒相当均勾，高分辨TEM图片表明小的金纳米团簇均勾的分布在一起形成金纳米颗粒。
[0060](2)动态光散射(DLS)测量:
[0061]金纳米团簇自组装形成的金纳米颗粒在水溶液中的粒径分布在较窄的范围内，平均粒径为198nm-200nm)，见图2〇[〇〇62](3)扫描透射显微镜(STEM)测量:
[0063]从结果图片中可以清晰看到金元素和钆元素均匀的分布在自组装形成的金纳米颗粒中，这证明了Gd3+成功诱导了金纳米团簇的自组装(见图3)。[〇〇64](4)弛豫时间以及材料的CT成像效果测量:[〇〇65]自组装形成的金纳米颗粒的X-射线衰减强度明显高于单独的金纳米团簇和临床 CT造影剂Omnipaque(见图4中A)。自组装金纳米材料的T1弛豫时间约是临床常用的T1造影剂Gd-DTPA的5.3倍(见图4中B)。这些结果证明形成的自组装金纳米颗粒可以作为CT以及 MRI成像的造影剂。[〇〇66](5)细胞相容性的实验结果[〇〇67]结果如说明书图5所示。MTT试验结果表明，即使在550mM这么高浓度的金存在下，细胞仍保持较高的存活率。说明合成的自组装金纳米材料具有较好的生物相容性，可以用于动物体内试验。[〇〇68](6)肿瘤的多模态成像诊断[〇〇69]150此自组装金纳米颗粒尾部静脉注射进体重为20g的小鼠体内，通过核磁共振成像仪扫描测得到的图片(图6)所示，从图中可以清楚的看到肿瘤部位信号随时间变化先增加后下降的现象，且小鼠没有死亡。证明合成的材料具有较低的毒性和较好的MRI成像效果。
[0070]同样注射方法用于观察肿瘤的CT成像，图7表明材料在肿瘤的CT成像中也有较好的应用潜能。
[0071]为了验证合成的自组装金纳米颗粒是否具有荧光成像效果，20iiL的材料采用瘤内注射的方法，观察肿瘤荧光成像效果。结果表明24小时内肿瘤的荧光成像效果都很明显(图 8)〇
[0072]以上结果表明合成的自组装金纳米材料在肿瘤的多模态成像中具有很好的应用前景。
[0073]本发明以Gd3+为诱导剂，诱导金纳米团簇的自组装形成的金纳米颗粒材料作为肿瘤的多模态成像造影剂。A549细胞构建皮下肿瘤模型作为本发明的模式肿瘤来检测材料肿瘤成像效果。TEM、SEM以及STEM的结果证明金纳米团簇在Gd3+的诱导下自组装成了金纳米颗粒。自组装的金纳米颗粒，分散均匀，结构均一，水动力大小约200nm。细胞的MTT实验成功证明组装的金纳米颗粒具有很好的生物相容性以及安全性。裸鼠的皮下肺癌肿瘤模型证明组装得到的金纳米内部包含金纳米团簇以及Gd3+能够用于肿瘤的荧光成像，CT成像以及MRI成像。[〇〇74]本发明制备的三价钆离子(Gd3+)诱导的金纳米团簇自组装产物，方法简单，材料合成成本低，反应条件简单，易于操作，制备得到的金纳米颗粒具有增强的荧光成像以及CT成像效果，螯合了 Gd3+可以作为肿瘤核磁成像造影剂。实验结果表明制备得到的金纳米颗粒在肿瘤的多模态成像领域具有广阔的应用前景。
[0075]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤:金纳米团簇的制备步骤:以手性L型谷胱甘肽作为巯基配体制备的金纳米团簇，将金纳米团簇溶于去离子水中，形成溶液A;三价钆离子Gd3+溶液制备步骤:将三价钆离子Gd3+溶于去离子水中，配成溶液B，超声后 备用；三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤:将溶液B缓慢滴加入溶液A中，诱导其 中金纳米团簇自组装成金纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其特征在 于，所述金纳米团簇的制备步骤中:金纳米团簇为手性谷胱甘肽作为巯基配体制备的金纳 米团簇，其中谷胱甘肽和金原子的摩尔比例为18:22，金纳米团簇溶于6.2〈pH〈7.0的去离子 水中。3.根据权利要求1所述的Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其特征在 于，所述三价钆离子Gd3+溶液制备步骤中:三价钆离子Gd3+来自六水氯化钆(GdCl3 ? 6H20)， 三价钆离子Gd3+溶液为新鲜配置的溶液。4.根据权利要求1所述的Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其特征在 于，所述三价钆离子Gd3+溶液制备步骤中:三价钆离子Gd3+溶液溶于6.2〈pH〈7.0的去离子水 中，80-120W超声2-3min后备用。5.根据权利要求1-4任一项所述的Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其 特征在于，所述三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤中:反应的三价钆离子Gd3+ 和金纳米团簇的摩尔比为1.1:1-1.5:1。6.根据权利要求1-4任一项所述的Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其 特征在于，所述三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤中:反应的金纳米团簇和三 价钆离子Gd3+的体积比为4:1。7.根据权利要求1-4任一项所述的Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其 特征在于，所述三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤中:反应的Gd3+缓慢滴加到 金纳米团簇的溶液中，滴加速度为350-450yL/min。8.根据权利要求1-4任一项所述的Gd3+诱导金纳米团簇自组装成金纳米颗粒的方法，其 特征在于，所述三价钆离子Gd3+诱导的金纳米团簇的自组装步骤中，反应条件为:1400-1600rpm/min 快速涡旋 30s-lmin，反应温度为 25-35°C，1200-1400rpm/min 搅拌 3h ?6h。9.一种上述权利要求1-8任一项方法得到的自组装金纳米颗粒的应用，其特征在于，所 述组装后金纳米颗粒作为肿瘤的多模态成像造影剂。10.根据权利要求9所述的自组装金纳米颗粒的应用，其特征在于，先进行组装后金纳 米颗粒(GNCNs)的纯化，然后将其用于肿瘤的多模态成像。11.根据权利要求10所述的自组装金纳米颗粒的应用，其特征在于，所述金纳米颗粒 (GNCNs)的纯化，是指:采用葡葡聚糖凝胶层析Sephadex G-150以及去离子水作为平衡液来 纯化得到的金纳米颗粒。
【文档编号】A61K49/18GK106075469SQ201610410696
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610410696.4, CN 106075469 A, CN 106075469A, CN 201610410696, CN-A-106075469, CN106075469 A, CN106075469A, CN201610410696, CN201610410696.4
【发明人】崔大祥, 侯文秀, 夏芳芳, 张春雷
【申请人】上海交通大学