专利名称：一种联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法
技术领域：
本发明涉及微球制备方法领域，具体涉及一种联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法。
背景技术：
生长因子是一类能刺激靶细胞产生某些生物效应的生物活性多肽或蛋白质，目前此类蛋白质药物主要包裹方式是采用有机溶媒如氯仿、二氯甲烷制备的高分子微球，会有遇到蛋白药物稳定性降低的问题，同时也会出现药物突释等问题。如何采用相对温和的条件包裹蛋白质药物保持其长效活性，并且实现可控释放，是目前药物载体系统研究的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的在于根据现有包括生长因子的药物载体中存在的稳定性降低、药物突释等问题，提供一种稳定性好、具有长效活性且可控释放的自组装载药微球的制备方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明以水溶性聚合物为囊材，包括蛋白质药物，采用高压静电使其分散成一定粒径的雾滴状胶囊，可避免使用传统乳化成囊法所需的有机溶媒。利用相同的原理，将含有蛋白质药物的海藻酸钠溶液在高压电场力的作用下分散成小液滴，使之与碱土金属离子交联形成微水凝胶，可以实现无毒包裹，并得到表面光滑、圆整、均勻性好的微球。一种联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，包括如下步骤
(1)以含有生长因子的海藻酸钠水溶液为原料液，以氯化钙溶液为凝胶浴，在高压静电场装置中制备微凝胶；
(2)用静电纳米层层自组装技术在微凝胶表面组装多层高分子聚电解质膜，得到自组装载药微球；
步骤(1)中，所述高压静电场装置由静电场发生器和注射器泵组成，所述原料液装入注射器泵上，将静电场发生器正极与注射器锐孔连接，负极与氯化钙凝胶浴连接，使锐孔和凝胶浴之间形成静电场；静电场发生器输出电压，在注射器泵的推动力和电场力的作用下，原料液克服黏滞力和表面张力，从锐孔以液滴状滴入氯化钙溶液中固化，形成包封了含有生长因子的海藻酸钙的微凝胶，生长因子会均勻分布于微凝胶中；
步骤(2)中，将微凝胶置于壳聚糖溶液中成膜反应后，去离子水洗除去未吸附的壳聚糖，再将其置于右旋糖酐硫酸钠溶液中成膜反应，再用去离子水洗除去未吸附的右旋糖酐硫酸钠，重复上述操作，逐层吸附壳聚糖和右旋糖酐硫酸钠，得到所需层数的自组装载药微球。作为一种优选方案，上述方法中，所述原料液含10ug/ml的bFGF和2wt%的海藻酸钠。作为一种优选方案，上述方法中，所述静电场发生器的输出电压为15kV。作为一种优选方案，上述方法中，所述成膜反应的时间为15min ；所述洗脱时间为 30s。作为一种优选方案，上述方法中，所述壳聚糖溶液中含有0. 1质量体积％的壳聚糖，PH值为5.6。作为一种优选方案，上述方法中，所述右旋糖酐硫酸钠溶液中含有0. 1质量体积％ 的右旋糖酐硫酸钠，pH值为5. 6。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
(1)将含有蛋白质药物的海藻酸钠溶液在高压电场力的作用下分散成小液滴，使之与碱土金属离子交联形成微水凝胶，可以实现无毒包裹，并得到表面光滑、圆整、均勻性好的微球；
(2)本发明通过层层自组装方法可以改变纳米层的厚度及组成，进而保护生长因子活性，并能有效避免突释，实现长效恒速率释放；而且，早期微球中生长因子的释放属于扩散机制，生长因子穿过表面的聚电解质多层纳米膜进行释放；在释放后期，海藻酸盐微凝胶由于交联点密度降低，出现基体崩解，同时聚电解质多层纳米膜发生降解，因此生长因子的释放同时受到扩散及降解两种机制调控，进而实现生长因子的控释；
(3)本发明的层层自组装这种层叠方式主要通过静电相互作用成囊，是一种弱相互作用力，基本上不会影响包载药物的性质，这对于稳定性差、生物半衰期短的多肽类药物来说，非常适合包载。
图1为高压静电液滴法制备微球的装置图； 图2为纳米层层自组装技术路线；
图3为本发明经过自组装后生长因子的释放速率。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例实验材料
海藻酸钠(251时^)水溶液的粘度为250cps)，Sigma公司；右旋糖酐硫酸钠(Mw > 5000 000)，Sigma公司；人碱性成纤维细胞生长因子，暨南大学生物工程研究所；壳聚糖 (粘度为4(TIOOMPa . s)，广州市齐云生物技术有限公司；human basic ELISA试剂盒，达科为生物技术有限公司；乙二胺四乙酸二钠，广州化学试剂厂；氯化钙(分析纯)，广州化学试剂厂；无水乙醇(分析纯)，天津市东丽区天大化学试剂厂；实验用水为Milli-Q (Integral 5)去离子水。连续变倍体视显微镜(Smz-T4)，重庆奥特光学仪器公司；扫描电子显微镜(XL-30), Philips公司；高压直流电源(DW-P503-4ACCD)，天津三川公司；微量注射器泵 (LSP01-1A)，保定兰格公司；数显气浴恒温振荡器(CHA-S)，江苏金坛有限公司；注射器 (2. 5ml)，浙江京环医疗用品公司。实验方法
采用高压静电液滴法制备海藻酸钙微球，实验装置如图1所示。以含10Ug/ml的bFGF 和2wt%的海藻酸钠水溶液为原料液，3. 0% (w/v)的CaCl2水溶液为接收器，微量注射器泵以5ml/h的速率推注出海藻酸钠水溶液，在电压为15kV的电场力作用下，海藻酸钠溶液克服表面张力及粘滞力，以一定粒径的液滴落入氯化钙溶液中，通过Ca2+与海藻酸钠交联固化形成不溶于水的海藻酸钙微球，固化20分钟，去离子水洗后，于pH值为5. 6的0. 1质量体积％的壳聚糖溶液中成膜反应，成膜时间为15min ；将微球取出，去离子水洗30s，于pH值为5.6的0. 1质量体积％的右旋糖酐硫酸钠溶液中成膜反应，成膜时间为15min。重复上述操作，逐层吸附壳聚糖和右旋糖酐硫酸钠，得到所需层数的自组装载药微球。1.包封率的测定
用3wt%乙二胺四乙酸二钠溶液溶解静电液滴法制备所得微球，10000rpm，4°C离心10 分钟，ELISA方法测定上清液中bFGF含量，计算微球包封率。包封率=(实测值/理论值)％。表1药物包封率数据
理论值/ng780实测值/ng450包封率％57.69231
2.体外释放
将上诉所得不同叠层层数的微球置于5ml的PH=7. 4的PBS溶液中，37°C，IOOrpm恒温振荡器中进行体外药物释放，特定的时间取Iml上清液，加入相同体积的新鲜PBS，ELISA试剂盒测试生长因子含量，计算药物累积释放率，绘制bFGF累计释放曲线。药物累积释放率％= (t时间药物释放总量/实际载药量)％。表2不同叠层层数微球药物累积释放率％
权利要求
1.一种联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，其特征在于包括如下步骤(1)以含有生长因子的海藻酸钠水溶液为原料液，以氯化钙溶液为凝胶浴，在高压静电场装置中制备微凝胶；(2)用静电纳米层层自组装技术在微凝胶表面组装多层高分子聚电解质膜，得到自组装载药微球；步骤(1)中，所述高压静电场装置由静电场发生器和注射器泵组成，所述原料液装入注射器泵上，将静电场发生器正极与注射器锐孔连接，负极与氯化钙凝胶浴连接，使锐孔和凝胶浴之间形成静电场；静电场发生器输出电压，原料液从锐孔以液滴状滴入氯化钙溶液中固化，形成包封了含有生长因子的海藻酸钙的微凝胶；步骤(2)中，将微凝胶置于壳聚糖溶液中成膜反应后，去离子水洗除去未吸附的壳聚糖，再将其置于右旋糖酐硫酸钠溶液中成膜反应，再用去离子水洗除去未吸附的右旋糖酐硫酸钠，重复上述操作，逐层吸附壳聚糖和右旋糖酐硫酸钠，得到所需层数的自组装载药微球。
2.根据权利要求1所述联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，其特征在于所述原料液含10ug/ml的bFGF和2wt%的海藻酸钠。
3.根据权利要求1所述联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，其特征在于所述静电场发生器的输出电压为15kV。
4.根据权利要求1所述联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，其特征在于所述成膜反应的时间为15min。
5.根据权利要求1所述联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，其特征在于所述洗脱时间为30s。
6.根据权利要求1所述联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，其特征在于所述壳聚糖溶液中含有0. 1质量体积％的壳聚糖，PH值为5. 6。
7.根据权利要求1所述联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法，其特征在于所述右旋糖酐硫酸钠溶液中含有0. 1质量体积％的右旋糖酐硫酸钠，PH值为 5. 6。
全文摘要
本发明公开了一种联合高压静电液滴法和层层自组装法制备自组装载药微球的方法。本发明是以含有生长因子的海藻酸钠水溶液为原料液，以氯化钙溶液为凝胶浴，在高压静电场中制备微胶囊，使生长因子均匀分布于微凝胶中，然后再用静电纳米层层自组装技术在微凝胶表面组装多层高分子聚电解质膜，得到自组装载药微球。本发明方法制得的自组装载药微球表面光滑、圆整、均匀性好，可保护生长因子的活性并有效避免突释，实现长效恒速率释放。
文档编号A61K47/36GK102258481SQ20111023975
公开日2011年11月30日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者何留民, 左琴华, 张奕, 施云峰, 薛巍, 谢莎莎, 黄跃新 申请人:薛巍