品100 μ L，之后在温度为37°C的条件下孵育30min，再以PBST洗涤液洗涤3次，备用；(同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔);
[0068]c.AuNFs-酶-免疫探针的结合:以抗体稀释液将AuNFs-酶-免疫探针以1:20?I: 100的比例稀释，之后在每孔中加入100 μ L，并在温度为37°C的条件下孵育lh，再以PBST洗涤液洗涤3?5次，备用；
[0069]d.显色:向酶标板的每孔中加入显色液100 μ L，之后在温度为37°C的条件下显色15min ;然后在每孔中加入终止液(浓度为2M的硫酸溶液50 μ L);最后用酶标仪测量波长为450nm处的吸光值A45。，建立A45。与抗原量的关系。与所作标准曲线对比算出待测样品中PSA的浓度。参阅图5?图6，本实施例中得到PSA检测的灵敏度为0.1ng/mL,比传统的ELISA方法检测的灵敏度1.0ng/mL提高了 10倍。
[0070]需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0071]应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种金纳米花免疫探针，其特征在于包括金纳米花粒子以及修饰于金纳米花粒子上的示踪酶标记的抗体；其中所述金纳米花粒子主要是以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得。2.根据权利要求1所述的金纳米花免疫探针，其特征在于所述示踪酶标记的抗体包括示踪酶标记单克隆抗体或多克隆抗体，所述示踪酶包括辣根过氧化物酶。3.根据权利要求1所述的金纳米花免疫探针，其特征在于所述金纳米花粒子的制备方法包括: (1)将粒径为10?15nm的金纳米粒子、氧化剂、壳聚糖于水相体系中充分混合后用频率为25kHz?45kHz的超声波处理5?lOmin，制得混合溶液，所述混合溶液中氧化剂的浓度为0.005wt %?0.02wt %，壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的浓度为1.04?4.16mg/mL，所述氧化剂包括氯金酸； (2)向步骤(I)制备的混合溶液中加入还原剂，直至还原剂的浓度为3.2mM?12.8mM，之后在无光条件下搅拌反应10?15min，制得所述金纳米花粒子，其中所述还原剂包括抗坏血酸或没食子酸。4.如权利要求1-3中任一项所述金纳米花免疫探针的制备方法，其特征在于包括:以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得金纳米花粒子，并将金纳米花粒子分散于质量浓度为0.02?0.lmg/mL的辣根过氧化物酶标记的抗体溶液中，在温度为(TC?8°C的条件下震荡Ih?5h，之后加入牛血清蛋白溶液进行封闭，直至牛血清蛋白的最终浓度为0.2wt%?Iwt %，然后在温度为20?27°C、转速为300?600rpm的条件下振荡0.5h?lh，获得所述金纳米花免疫探针。5.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述的金纳米花免疫探针。6.基于权利要求5所述试剂盒的检测方法，其特征在于包括: a、将所述的免疫探针与不同浓度的目标抗原标准样品进行酶联免疫反应，并记录检测信号，由此建立免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系； b、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤a建立的免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。7.基于权利要求5所述试剂盒的检测方法，其特征在于包括: A、将蛋白质与半抗原的偶联物溶于碳酸盐缓冲液中形成包被液，之后加入酶标板中，并在温度为25°C?37°C的条件下孵育I?4h，再以磷酸盐缓冲液洗涤，而后加入封闭液，并在温度为0°C?8°C的条件下封闭过夜，且蛋白质与半抗原的偶联物与碳酸盐缓冲液的体积比为1:9000?1:243000，制得包被抗原溶液，所述蛋白质包括卵清蛋白或牛血清蛋白； B、向步骤A中连接上包被抗原的酶标板中加入一系列不同浓度小分子标准品的磷酸盐缓冲液，之后加入含小分子抗体的酶标稀释液，再在温度为25°C?37°C的条件下孵育0.5?lh，最后用磷酸盐缓冲液洗涤，所述酶标稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.0lM?0.05M、pH值为7.0?8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1?0.5wt%的明胶和0.05?0.lv/v%的吐温-20，制得多个竞争反应混合体系； C、向步骤B制得的各个竞争反应混合体系中分别加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，其中，免疫探针和抗体稀释液的体积比为1:2000?1:3000，之后在温度为25°C?37 °C下孵育0.5h?2h，再以磷酸盐缓冲液洗涤，所述抗体稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.0lM?0.05M、pH值为7.0?8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1?0.5wt%的明胶和0.05?0.lv/v%的吐温-20，制得多个混合反应体系； D、向步骤C制得的各个混合反应体系中分别加入显色液，之后在温度为25°C?37°C下显色1min?30min，再加入浓度为2M?4M的硫酸溶液，最后测量各混合反应体系在450nm?650nm波长处的吸光值，建立吸光值与抗原量的标准对应关系； E、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤D建立的吸光值与抗原量的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。8.根据权利要求7所述试剂盒的检测方法，其特征在于步骤A中所述封闭液包括浓度为0.001wt%、分子量为2000?10000的聚乙二醇溶液。9.基于权利要求5所述试剂盒的检测方法，其特征在于包括: 1、将抗体溶于碳酸盐包被缓冲液中，形成蛋白质含量为Iμ g/mL?20 μ g/mL的溶液，之后将溶液转入酶标板中，并在温度为25°C?37°C的条件下孵育Ih?4h，再用磷酸盐缓冲液洗涤，最后加入含量为0.1wt %?5wt %的牛血清蛋白溶液，并在温度为(TC?8°C下封闭过夜； I1、向步骤I得到的酶标板中加入一系列不同浓度小分子标准品的磷酸盐缓冲液，在温度为25°C?37°C的条件下孵育0.5h?2h，并用磷酸盐缓冲液洗涤，制得多个结合反应混合体系； II1、向步骤II制得的各个结合反应混合体系中加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，之后在温度为25°C?37°C下孵育0.5h?3h，再用磷酸盐缓冲液洗涤，制得多个混合反应体系; IV、向步骤III制得的各个混合反应体系中分别加入显色液，之后在温度为25°C?37°C下显色1min?30min，再加入浓度为2M?4M的硫酸溶液，最后测量各混合反应体系在450nm?650nm波长处的吸光值，建立吸光值与抗原量的标准对应关系； V、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤IV建立的吸光值与抗原量的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。10.根据权利要求9所述试剂盒的检测方法，其特征在于步骤III中所述抗体稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.0lM?0.05M、pH值为7.0?8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1?0.5界七％的明胶和0.05?0.lv/v%的吐温-20。
【专利摘要】本发明公开了一种金纳米花免疫探针、其制备方法与应用。所述金纳米花免疫探针包括金纳米花粒子，且金纳米花粒子上修饰有示踪酶标记的抗体，其中所述金纳米花粒子主要是以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得。所述示踪酶标记的抗体包括示踪酶标记单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的金纳米花免疫探针较之传统的酶标记抗体免疫探针信号和检测灵敏度显著提升；本发明采用酶联免疫反应验证了金纳米花免疫探针的活性，该方法简便快速，重复性高；基于本发明金纳米花免疫探针的酶联免疫检测分析方法在较少改变传统检测方法成本的前提下，检测性能显著地提高。
【IPC分类】G01N33/531
【公开号】CN105158456
【申请号】CN201510553221
【发明人】彭池方, 潘娜, 王丽英
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月1日