专利名称：一种双标记纳米金探针及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种具有生物活性的双标记纳米金探针 及其制备方法和这种纳米金探针在超微量抗原检测中的应用。
背景技术：
近年来医学诊断技术迅速发展，免疫测定技术也日新月异.而作为免疫测定 技术的一个重要分支一标记免疫测定技术是最为活跃的。
1959年，美国学者Berson和Yalow建立放射免疫分析(Radio Immunoassay, RIA)法，这种标记免疫测定开拓了标记免疫测定的新领域。由于RIA具有灵敏 度高，特异性强,简便等优点，RIA具有一定的生命力，但因为它必须使用放射性 核素,需要防护、防止污染；标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自 动化等，它的进一步发展受到一些局限，因此，不少学者进行了新标记物的探索。
1971年，Engvall和Perlaman及Weeman和Schuur两组学者用酶代替同 位素制备酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术(Enzyme Immunosorbent Assay, EIA)。至今有二十多种酶已被应用于EIA，，其中以辣根过氧化物酶(HRP)和碱 性磷酸酶(AP)为主，EIA除了避免放射性同位素的危害外，更重要的优点是酶标 记物有效期更长，但普通的EIA灵敏度不高，而后来发展的荧光免疫分析 (Immunofluorescence Assay, FIA)禾卩化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)提高灵敏度和检测发范围。
发现和应用新的标记物是免疫测定技术的主要研究方向之一，纳米技术的介 入也为标记免疫测定技术的研究发展提供了无穷的想象空间。纳米粒子(英文名 称为nanoparticles)是指粒径在1-100范围内的粒子，也称超微粒子(英文名称为ultrafine particles),其处在原子和宏观物体交界的过渡区域内，具有特 殊的性能。纳米粒子本身具有小尺寸效应，表面效应，化学反应活性等独特的物 化特性，能与生物体有特殊的相互作用，因此，以纳米微粒、脂质体等作为标记 物载体放大反应的方法应用广泛。其中，以纳米金标记免疫测定尤为突出。
1971年，faulk等将纳米金与兔抗沙门氏菌血清结合，用免疫细胞化学技术检 测沙门氏菌的表面抗原，开创纳米金标技术(Faulk,CM.Taylar.An immunocolloidal method for the electron microscope.Immunochemistry. 1971,8:1080-1084.) 。 1981年， Danscher建立了用银显影液增强光镜下金颗粒的可见性的免疫金银染色法
(Immunogold—sliver staining, IGSS)，目前被广泛应用于医学和细胞生物学研 究领域，是目前免疫组织化学技术中较常用的敏感方法之一。
目前，在快速免疫诊断方面，以斑点免疫金银染色(Dot-immunogold silver staining,Dot—IGSS)，快速免疫金渗滤法(Dot画immunogold filtration assay, DIGFA) 和免疫金层析法(immunochromatography， GICA)，三种为主。1989年，Spielberg 等最先发展了以纳米金为标记物的渗滤试验，用于检测艾滋病病毒抗体，确立斑 点免疫金渗滤法(Dot-immunogold filtration assay, DIGFA) 。 Beggs等最先将金 胶用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定(Beggs M, Novotny M， Sampedro S," a/. A self-performing chromatog画raphy immunoassay for the quanlitative determination of HCG in urine and serum. Clin. Chem.， 1990, 36(6): 1084-1085.)
纳米金标记抗体，并可通过银显影放大信号。DuanL等利用纳米金标记作为 报告分子，建立一种同时快速检测乙型，丙型肝炎病毒的蛋白芯片(抗体芯片) 检测法，与常规ELISA检测法相比，无明显差异(DuanL，WangY，LiSS,^a/. Rapid and simultaneous detection of human hepatitis B virus and hepatitis C virus antibodies based on a protein chip assay using nano-gold immunological amplificationand silver staining method. 6MC /A7fecf D/s. 2005; 5: 53.)。
从同位素、酶、荧光素，.胶体金的开发和应用新的标记物，目的无非是为 了提高免疫测定的灵敏度、特异性、稳定性或简便性。近几年，以核酸作为标记 物设计免疫测定方法也成为科学家研究热点。纳米金可与烷巯基修饰的核酸之间 形成很强的Au-S共价键而结合，二巯基乙醇或巯基乙醇又可以与Au-S共价键发 生替换将核酸取代下来。以DNA的扩增或转录翻译为基础的，通过聚合酶链反应 (polymerase chainreaction， PCR)在数小时扩增数百万倍，这种信号放大远非 核素、酶、荧光素或元素等通常的标记物所能及，因而DNA标记免疫测定具有极 高的检测灵敏度。
美国西北大学纳米技术研究所Chad A. Mirkin教授领导的研究小组建立了以 DNA标记免疫测定为基础的"生物条码核酸芯片检测法"(Nam JM， Thaxton CS,
Proteins. SCIENCE,2003,301:1884-1886)。结果检测灵敏度高，检测下限比传统 ELISA法低至6个数量级，不仅适用于DNA还适用于蛋白质。2006年，研究小组成 功应用此法同时检测PSA， HCG， AFP (Stoeva SI， Lee JS， Smith JE ， W a丄 Multiplexed Detection of Protein Cancer Markers with Biobarcoded Nanoparticle Probes. J. AM. CHEM. S0C. 2006， 128:8378-8379.)，另外，他 们还用此法检测脑脊液中微量ADDL蛋白，而普通检测方法难以检测到ADDL，阐明 了死后被诊断为老年痴呆患者的脑脊液中高于健康个体的ADDL蛋白浓度，有利于 老年痴呆症的早期诊断(Georganopoulou DG, Lei Chang， Nam JM， a丄 Nanopaxticle-basecl detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer' s disease. PNAS， 2005， 102(7):2273 -2276)。发明专利申请公开说明书(公开号CN 1339609A;国别中国；公
开日2002年3月13日)公开了一种纳米金标记基因探针，其中采用采用
纳米金与烷巯基修饰的核酸结合形成探针，用于诊断型基因芯片领域，但其不能 用于免疫测定，在实际推广应用上存在困难。
发明内容
为了克服上述常规微量抗原检测技术存在问题，提高检测灵敏度特异性，本 发明的目的是提供一种由纳米金表面同时共价结合寡核苷酸单链分子，静电吸附
抗体分子而构成的纳米金探针；本发明的另一个目的是提供一种本发明的纳米金 微粒标记探针的制备方法；本发明还有一个目的是纳米金探针在超微量抗原检测 中的应用。
以下是本发明的技术方案。
一种双标记纳米金探针，该探针包括纳米金粒子为核，表面同时连接抗体 和寡核苷酸。
所述纳米金探针平均粒径为20-60nm。 _ ，
所述纳米金探针平均粒径为30-50nm。通常，粒径范围为10—240nm之间。 其中所述抗体是通用IgG，所述的通用IgG是多克隆抗体或单克隆抗体之一 或其组合。
其中所述的抗体是羊抗小鼠IgG、抗人PSA多克隆抗体、抗人HCG多克隆抗 体、抗人HBV多克隆抗体、抗人HIV多克隆抗体、抗人ADDL多克隆抗体、抗人 心纳素(ANP)多克隆抗体、抗人NSE多克隆抗体、抗人C一肽多克隆抗体或 单克隆抗体之一或其组合。
所述的寡核苷酸是巯基修饰的单链DNA或RNA分子之一或其组合。寡核苷 酸单链分子的设计以及委托合成与修饰，采用易于与纳米金微粒表面交连固定的活性基团-巯基(-SH)对寡核苷酸单链分子进行修饰，为克服连接时候的空间位 阻问题，寡核苷酸片段-SH端增加了烷氢基团，并连接了 10个腺嘌呤(A)作为"手 臂"以有活动空间。
所述的寡核苷酸的片段的长度是10 50bp，过长的片段容易缠绕在纳米金粒 子表面。
本发明还提供上述的双标记纳米金探针的制备方法，包括如下的步骤
① 连接反应在浓度为2—6nM纳米金溶胶中加入浓度为6.6 33ug/ ml核酸 溶液、浓度4-10ug/ml抗体溶液，混合均匀，在温度为4 3(TC，控制反应pH值为 6~9，时间为10 20h，使溶液中纳米金粒子和抗体、核酸能充分作用，制成混合 液；
② 稳定和封闭反应配置含SDS量为5-10Q/。的PBS缓冲溶液，其中PBS的量为 0.01-0. 1M，然后加入步骤①所制成的混合液中，控制活性剂SDS的终浓度为 0.005-0.015%，混和均匀，然后逐渐加入O. 3-1. 2M的稳定剂，边加边混匀，最终 控制稳定剂的浓度为O. 1M 0.2M，静置平衡6-12h以上，最后，加入封闭剂，， 控制终浓度为O. 5% 1%，混匀平衡，形成纳米探针的溶胶。
所述的纳米金溶胶浓度，较好的为3. 0nM，更好的则为3. 3nM。 其中所述的稳定剂是NaCl水溶液，所述的封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)。 由于纳米金探针自组装的稳定和封闭，只有严格控制反应条件，才能使寡核
苷酸片段，抗体分子牢牢地集合在纳米金表面，从而避免发生不可逆的聚沉。使
用牛血清蛋白(BSA)为稳定剂，封闭多余的位点，减少探针非特异性吸附，并
以适量的表面活性剂SDS改善微粒的分散性能。
其中步骤①所述的混合均匀为先用涡旋器混匀，然后采用摇床50-900r /
min轻摇o '其中步骤①所述的寡核苷酸是巯基修饰的单链DNA或RNA分子之一或其组合。
其在步骤①之前，还包括步骤
(1)柠檬酸三钠还原法制备纳米金将0. 005%—0. 04%的HAuC14溶液加热 至沸腾，高速搅拌条件下快速加入的0.5%--3%柠檬酸三钠溶液，其中所需的 HAuC14溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为100: 8--100: 2，继续加热搅拌至混 合均匀，然后自然冷却，形成纳米金溶胶。
其在步骤(l)之后，还包括步骤:把步骤(l)所得纳米金溶胶用0. 18—0. 25 um 滤膜过滤。
也可采用外购的纳米金溶胶。
其在步骤②之后，还包括步骤
低温超速离心纯化对步骤②中的纳米金探针的溶胶，进行
12000~16000r/min转速下的离心，离心时间为15 45min，温度控制在4-8度， 除去上清液，用0.01%~0. 10%叠氮化纳的洗涤液反复洗涤，4 8匸保存。
纯化后，可以通过透射电镜(TEM)和紫外光谱的方法对探针进行表征分析。 所述制备的纳米金生物探针，微粒表层覆盖有通过Au-S共价键牢固结合的 寡核苷酸片段，二巯基乙醇(DTT)或巯基乙醇(MCE)作为还原剂将寡核苷酸替 换下来。以紫外-可见分光光度计波长扫描观察DTT作用的动力变化。
具体步骤可以如下取2.9 nM的制备好的纳米金探针2.5ml，加入0. 1M 二 巯基乙醇(DTT)至终浓度为0. OIM，静置一段时间后紫外扫描一次，观察吸收峰、 吸光度和颜色的变化。具体的取用量可根据实际情况变动。
其中寡核苷酸片段的覆盖量的检测方法可为荧光标记检测法。
将FAM标记的寡核苷酸结合于金粒子，采用荧光分光光度计检测FAM荧光量，并计算DNA的连接覆盖量。具体步骤可以如下取3.0nM， 4ml制备好的纳 米金探针，加入O. 1M二巯基乙醇(DTT)至终浓度为0.01M，静置充分作用，离 心取得上清，FAM标准曲线的制备在相同pH，离子强度，DTT浓度的条件下， 检测已知浓度的寡核苷酸(FAM)和未知浓度的上清。具体的取用量可根据实际 情况变动。
有关检测方法的参考文章，为Kim EY， Jennifer Stanton， Vega RA, et al.A real-time PCR-based method for determining the surface coverage of thiol-capped oligonucleotides bound onto gold nanoparticles. Nucleic Acids Research, 2006， 34(7) :47-54。
所述制备的纳米金生物探针，纳米金粒子表层连接有多克隆抗体，采用斑点 免疫金渗滤测定抗体活性。具体步骤可以如下将5ul抗原结合于经处理过的 硝酸纤维素膜上，以5 u 1羊抗兔为阴性对照和不点样为空白对照，室温干燥，置 于自制渗滤盒中。加入0.01M PBS (含P/。BSA) 100pl封闭，加入50ul纳米金 生物探针，经过37。C孵育30min， PBST洗涤液洗涤后观察结果。具体的取用量可 根据实际情况变动。 .
一般来说，抗体连接量与投入量在一定范围内是呈正相关，因此，用Bradford 法检测新型免疫金探针上抗体吸附情况。通过公式探针抗体连接量=抗体投入 量一抗体残余量，粗略计算纳米金粒子与抗体的连接率。所述制备的纳米金生物 探针，纳米金与多克隆抗体结合的最低稳定量为5yg/ml，最适稳定量为6-7u g/ml。
通过PCR检测寡核苷酸片段的方法，检测所述制备的纳米金探针表面寡核 苷酸片段标记抗原抗体反应。具体步骤可以如下取35 u 1， 100" g/ml免疫磁性 微球，PBS重复洗涤，加入一定量的金探针(2.5nM)， PBS定容至2ml， 37。C水浴振荡lh，磁场分离，洗涤液洗涤(0.01M，pH7.4PBS，0. 15MNaCl)，重复数次。收 集磁场分离物(免疫磁珠和金探针连接物)。加入DTT作用，超速离心取得上清， 作为PCR扩增样品。扩增后将产物用饱和尿素处理，高温55。C水浴10min，速冻， 立即做含7M尿素的18%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
所述双标记纳米金探针的应用，其在于该探针能将抗原的检测转化为对核酸 物质的检测，应用于肿瘤标记志物、激素、病原体微量蛋白质的检测。
本发明中未指明的百分含量为重量百分比，未特别说明的溶液都是水溶液。 通过以上我们可以看出，本发明将纳米表面合成组装技术、免疫学技术、生 物化学技术相结合，解决纳米金表面修饰及其与多克隆抗体和寡核苷酸片段各同 时连接的关键技术，要求既不影响免疫反应中抗原抗体的特异性结合，又不影响 寡核苷酸片段连接和检测。本发明通过公开纳米金探针、该种纳米金探针的制备 方法、该种纳米金探针的应用，就可以用寡核苷酸片段来标记抗原和抗体，然后 再通过PCR技术对寡核苷酸判断，检测信号放大的寡核苷酸量，即可获知结合的 超微量蛋白质，从而大大提高检测灵敏度。本发明适用于各类抗原的检测，包括 早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原的检测。本发明最大的特点是寡核苷酸可 标记抗原抗体反应，将抗原等物质的检测转化为对核酸物质的测定，从而提高检 测灵敏度，且具操作方法简便、快速等特点。可用于早期癌抗原及某些神经肽等 超微量抗原检测，有很好的临床应用价值。
图1是实施例1纳米金与1. 2M NaCl混合透射电镜图，。 图2是实施例5双标记纳米金探针粒径及分布图。 图3是实施例5的双标记纳米金探针透射电镜图。 图4是实施例5的紫外-可见分光光度计扫描结果图。图5是实施例5的斑点免疫金渗滤。
图6是实施例6的DTT取代探针上巯基DNA的时间变化曲线图。
图7是实施例6的探针上寡核苷酸PAGE结果。
图8是实施例7的ssDNA加入量与连接量情况示意图。
图9是实施例7的免疫金银染色法观察结果图。
具体实施方式
一、纳米金的制备 实施例1:
柠檬酸三钠(上海国药)还原HAuCl4法制备胶体金。将100 ml 0. 01%的HAuCh 溶液加热至沸腾；高速搅拌条件下(1200rpm)快速加入5ml 1%柠檬酸三钠 (Na3CeH507 2H20)，继续加热搅拌30min，自然冷却，用超纯水恢复至原体积。 0.22 iim滤膜过滤，4"避光保存备用。
如图1所示，所得纳米金用透射电子显微镜(TEM)观察粒子的形貌，用激 光散射仪测定其大小和粒径分布，用紫外-可见光分光光度计扫描观察吸收峰值并 根据朗伯-比尔定律估算纳米金的浓度。
实验结果所得纳米金在518 mn有蕞大的吸收峰，粒度均匀，分散性良好， 主要分布范围在10土3nm，金胶大概的浓度为3. 7nM。
注意，以下实施例未提及部分与实施例1相同。 实施例2:
取100 ml 0.01%的HAuC14溶液加热至沸腾；高速搅拌条件下快速加入 2.5-4.5ml 1%拧檬酸三钠(N&QlsOz 2H20)，继续加热搅拌30 min，自然冷却， 用超纯水恢复至原体积。0.22 um滤膜过滤，4"C避光保存备用。
实验结果所得纳米金粒子粒径约在520 -534 nm有最大的吸收峰，粒径约为15-30 nm。
二、抗体结合纳米金的最佳pH和最适稳定量的确定 实施例3:
采用最优化的制备条件实施例1所制取的纳米金，取若干个1. 5ml小试管， 分别加入1 ml纳米金溶液；用Na2C03将pH分别依次调为3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10;取一96孔板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100y l加入孔中， 重复;.每孔分别加入2 u 1浓度为1 mg/ml的抗原或抗体，混合，室温下放置10-15 min;而后每孔分别加入一定量的1. 2M的NaCl溶液，混合，室温下放置10 min;. 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X);并且重复重复以上步骤，pH
梯度为X-0.6; X-0.3; X; X+0. 3; X+0. 6; X+l。观察胶体金颜色变化直到室温下
放置2小时，记录仍保持红色的即为最低pH。
实验结果测得纳米金溶液和抗体结合稳定的最佳pH为8-9。
实施例4:
采用最优化的制备条件实施例1所制取的纳米金，取5-10支试管，分别加入 胶体金lml， 0. 1M Na2C。3调pH值至9;各管依次加入不同量的IgG (1， 2， 4， 8， 10， 16倍比)，混匀，室温下放置15min;加入一定量的NaCl (终浓度为2. 5M)， 室温下放置20min;最后，颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。为 确保结果准确性，重复实验。
实验结果所得最小蛋白浓度为5ug，最佳结合量往往为最小浓度的130%,即6. 5 U g/ral。
三双标记纳米金探针的制备 实施例5
采用最优化的制备条件实施例1所制取的纳米金。依照实施例4调节纳米 金溶液的pH值，实施例5确定抗体结合的最适稳定量范围。即取2.5ml胶体金溶液，用O. 1M ， 75ul Na2Co3调pH值至9，按比例加入一定量3，-端烷氢硫醇 修饰的寡核苷酸(0.40D/ml)(上海生工合成)，马上涡旋混匀半小时，再加入 小鼠IgG (7ng/ml)(北京鼎国公司)，涡旋混匀，轻摇l-3h， 4"C避光静置过 夜。
加入0.01M， pH7.4的PBS， 10。/。的SDS使其终浓度为0.01%，旋涡混匀，置于 摇床中轻摇30min，逐渐加入1.2M的NaCl溶液使终浓度为0. 15M，边加边旋涡混 匀，静置平衡12h以上，稳定的寡核苷酸连接。最后，加入5%的牛血清白蛋白(BSA) 使最终浓度为1%，混匀平衡。
取上述制备好的探针，12000r/min ， 40 min， 4"C，轻去上清液除去未结 合的抗体和寡核苷酸，0. OIM， pH7. 4的PBS和0. 15M NaCl溶液(含0. 1% BSA) 重复洗涤红色油状沉淀，最后加入储存液4。C保存备用。
用TEM、紫外光谱和激光散射仪对其进行形貌观察、表征分析和粒度检测。 如图2所示，是用激光散射仪检测得到的双标记纳米探针的粒径及分布图。图3 是TEM作的双标记纳米金探针透射电镜图。图4是用紫外-可见分光光度计做的 紫外光谱图。
斑点免疫金渗滤法可用来观察探针上抗体活性，图5是斑点免疫金渗滤图。 可用二巯基乙醇(DTT) (Sigma公司)作用探针进行动力学分析，荧光标记法检 测探针表面寡核苷酸的覆盖率，同时采用用凝胶电泳的方法检测了金表面寡核苷 酸的存在。
如实验结果所得纳米金粒子的外貌为球形，平均粒径为10 ±3 nm，分散性 和稳定性良好。纳米金粒子表面连接抗体和寡核苷酸后，可见光吸收峰由518nm 红移到524mn，探针具有较好的抗体生物活性，探针表面寡核苷酸覆盖率约为(92 ±20)条，透射电镜和紫外分光光度计观察其表征图2。注意，以下实施例未提及部分与实施例5相同。
实施例6
采用最优化的制备条件实施例1所制取的纳米金。依照实施例4调节纳米金溶液 的pH值，实施例5确定抗体结合的最适稳定量范围。取2.5ml胶体金溶液，用 0. 1M ， 75 u 1 Na2Co3调pH值至9，按比例加入小鼠IgG (7u g/ml)(北京鼎国 公司)，涡旋混匀，30 min后加入一定量3'-端垸氢硫醇修饰的寡核苷酸 (0.40D/ml)(上海生工合成)，涡旋混匀，避光静置过夜。
加入0.01M， pH7. 4的PBS， 10。/。的SDS使其终浓度为0. 01%，旋涡混匀，.置于 摇床中轻摇30min，逐渐加入l. 2M的NaCl溶液使终浓度为0. 1M，边加边旋涡混匀， 静置平衡12h以上，稳定的寡核苷酸连接。最后，加入5%的牛血清白蛋白(BSA) 使最终浓度为1%，混匀平衡。
实验结果所得纳米金粒子的外貌为球形，平均粒径为10 土3nm，分散性和 稳定良好。探针具有较好的抗体生物活性，探针表面寡核苷酸覆盖率约为(70士 20)条。
可用二巯基乙醇(DTT) (Sigma公司)作用探针进行动力学分析，图6是实 施例6的DTT取代探针上巯基DNA的时间变化曲线图。
用凝胶电泳的方法检测了金表面寡核苷酸的存在，图7是实施例6的探针上 寡核苷酸PAGE结果。 实施例7
采用最优化的制备条件实施例1所制取的纳米金。依照实施例4调节纳米金 溶液的pH值，实施例5确定抗体结合的最适稳定量范围。取2.5ml胶体金溶液， 用0. 1M ， 75 u 1歸。3调pH值至9，按比例加入小鼠IgG (7 u g/ml)(北京鼎 国公司)，涡旋混匀，30 min后加入一定量3'-端烷氢硫醇修饰的寡核苷酸(0.40D/ml)(上海生工合成)，涡旋混匀，避光静置过夜。_
加入0.1M， pH7.4的PBS， 10。/。的SDS使其终浓度为0.0P/。，旋涡混匀，置于摇 床中轻摇30min，逐渐加入1.2M的NaCl溶液使终浓度为0. 15M，边加边旋涡混匀， 静置平衡12h以上，稳定的寡核苷酸连接。最后，加入5%的牛血清白蛋白(BSA) 使最终浓度为1%，混匀平衡。
实验结果所得纳米金粒子的外貌为球形，平均粒径为10 士3nm，分散性和 稳定良好。探针纯化过程中出现严重的贴壁现象，分散性和稳定性变差。
荧光标记法检测探针表面寡核苷酸的覆盖率，图8是实施例7的ssDNA加入 量与连接量情况示意图。
图9是实施例7的免疫金银染色法观察结果图。 实施例8
采用最优化的制备条件实施例1所制取的纳米金。依照实施例4调节纳米金 溶液的pH值，实施例5确定抗体结合的最适稳定量范围。取2.5ml胶体金溶液， 用0.1M ， 75"1 Na2C03调pH值至9，按比例加入小鼠IgG (7ug/ml)(北京鼎 国公司)，涡旋混匀，室温静置30min-lh，并加入5。/。BSA溶液使其终浓度为1%， 12000r/min ， 40 min， 4°C ，轻去上清液除去未结合的抗体，重复操作二次，0. OIM， pH7.4的PBS (含1%BSA)复溶，加入一定量3，-端烷氢硫醇修饰的寡核苷酸 (0. 40D/ml)，加入O. 1M， pH7. 4的PBS， 10%的SDS使其终浓度为0. 01%，旋涡 混匀，置于摇床中轻摇30min，逐渐加入1. 2M的NaCl溶液使终浓度为0. 15M, 12000r/min ， 40 min， 4°C，轻去上清液除去未结合的寡核苷酸。
实验结果所得纳米金探针分散性和稳定性良好。探针抗体生物活性良好，探 针表面寡核苷酸覆盖率约为(50土18)条。探针纯化过程中出现偶尔出现贴壁现 象。实施例9
采用最优化的制备条件实施例1所制取的纳米金。依照实施例4调节纳米金 溶液的pH值，实施例5确定抗体结合的最适稳定量范围。取2.5ml胶体金溶液， 加入一定量3，-端垸氢硫醇修饰的寡核苷酸(0.40D/ml)，加入0. 1M， pH7.4 的PBS， 10。/。的SDS使其终浓度为0.0P/。，旋涡混匀，置于摇床中轻摇30min，逐 渐加入1. 2M的NaCl溶液使终浓度为0. 2M， 12000r/min ， 40 min， 4°C ，用0. 1M ， 75txl Na2Co3调pH值至9，按比例加入小鼠IgG (7ug/ml)(北京鼎国公司)， 涡旋混匀，室温静置30 min-lh，并加入5%BSA溶液使其终浓度为1°/0， 12000r/min , 40 min， 4°C ，轻去上清液除去未结合的抗体，重复操作二次，0. OIM， pH7.4的PBS (含1XBSA)复溶，储存。
实验结果所得纳米金探针分散性和稳定性良好。探针表面寡核苷酸覆盖率约 为(110土12)条，抗体连接率降低。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因 此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而 不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明权利要求 书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的范围之内。
权利要求
1、一种双标记纳米金探针，该探针包括纳米金粒子为核，表面同时连接抗体和寡核苷酸。
2、 根据权利要求1所述的纳米金探针，所述纳米金探针平均粒径为20-60nm。
3、 根据权利要求1所述的纳米金探针，所述纳米金探针平均粒径为30-50nm。
4、 根据权利1--3任一所述的纳米金探针，其中所述抗体是通用IgG，所述的通 用IgG是多克隆抗体或单克隆抗体之一或其组合。
5、 根据权利1--3任一所述的纳米金探针，其中所述的抗体是羊抗小鼠IgG、抗 人PSA多克隆抗体、抗人HCG多克隆抗体、抗人HBV多克隆抗体、抗人HIV多 克隆抗体、抗人ADDL多克隆抗体、抗人心纳素ANP多克隆抗体、抗人NSE多 克隆抗体、抗人C—肽多克隆抗体或单克隆抗体之一或其组合。
6、 根据权利1—3任一所述的纳米金探针，所述的寡核苷酸是巯基修饰的单链 DNA或RNA分子之一或其组合。
7、 根据权利1…3任一所述的纳米金探针，所述的寡核苷酸的片段的长度是 10 50bp。
8、 一种权利要求1-7任一所述的双标记纳米金探针的制备方法，包括如下的步骤① 连接反应在浓度为2—6nM纳米金溶胶中加入浓度为6.6~33ug/ ml寡核 苷酸溶液、浓度4-10ug/ml抗体溶液，混合均匀，在温度为4 3(TC,控制反应pH 值为6~9，时间为10~20h，使溶液中纳米金粒子和抗体、核酸能充分作用，制 成混合液；② 稳定和封闭反应配制含SDS的量为5-10y。的PBS缓冲溶液，其中PBS的量 为O.Ol-O. 1M，然后加入步骤①所制成的混合液中，控制活性剂SDS的终浓度为 0.005-0.015%，混和均匀，然后逐渐加入0.3-1.2M的稳定剂，边加边混匀，最终控制稳定剂的浓度为O. 1M 0.2M，静置平衡6-12h以上，最后，加入封闭剂， 控制封闭剂的终浓度为O. 5%~1%，混匀均匀，形成纳米探针的溶胶。
9、 根据权利要求8所述的制备方法，其在步骤①之前，还包括步骤(1)柠檬酸三钠还原法制备纳米金溶胶将0. 005%—0. 04%的HAuCl4溶液加热 至沸腾，高速搅拌条件下快速加入的0.5%—3%柠檬酸三钠溶液，其中所需的 HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为100: 8--100: 2，继续加热搅拌至混 合均匀，然后自然冷却，形成纳米金溶胶。
10、 根据权利要求9所述的制备方法，其在步骤(1)之后，还包括步骤 把步骤(1)所得纳米金溶胶用0. l—O. 25 p m滤膜过滤。
11、 根据权利要求8所述的制备方法，其在步骤②之后，还包括步骤 低温超速离心纯化对步骤②中的纳米探针的溶胶，进行12000 16000r/min转 速下的离心，离心时间为15 45min，温度控制在4-8度，除去上清液，用 0.01°/。~0. 10%叠氮化纳的洗涤液反复洗涤，4 8r保存。
12、 根据权利要求8所述的制备方法，其中所述的稳定剂是NaCl水溶液，所述 的封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)。
13、 根据权利要求8所述的制备方法，其中步骤①所述的混合均匀为先用涡 旋器混匀，然后采用摇床50-900r/min轻摇。
14、 根据权利要求8所述的制备方法，其中步骤①所述的寡核苷酸是巯基修饰 的单链DNA或RNA分子之一或其组合。
15、 一种权利要求l--7任一所述双标记纳米金探针的应用，其在于该探针能将 抗原的检测转化为对核酸物质的检测，应用于肿瘤标记志物、激素、病原体微 量蛋白质的检测。
全文摘要
本发明公开了一种双标记纳米金探针及其制备方法和应用。该探针包括纳米金粒子为核，表面同时连接抗体和寡核苷酸。所述的双标记纳米金探针的制备方法，包括如下的步骤①连接反应在纳米金溶胶中加入浓度为寡核苷酸溶液、抗体溶液，混合均匀，使溶液中纳米金粒子和抗体、核酸能充分作用，制成混合液；②稳定和封闭反应配制含SDS的量为5-10％的PBS缓冲溶液，然后加入步骤①所制成的混合液中，加入封闭剂，形成纳米探针的溶胶。该双标记纳米金探针能将抗原的检测转化为对核酸物质的检测，应用于肿瘤标记志物、激素、病原体微量蛋白质的检测。
文档编号G01N33/52GK101551385SQ20081021587
公开日2009年10月7日 申请日期2008年9月3日 优先权日2007年9月3日
发明者任莉莉, 周汉新, 孔小丽, 李富荣, 晖 齐 申请人:深圳市人民医院