酶偶联核酸-银纳米的探针在检测d-氨基酸的应用
【专利摘要】本发明公开了一种酶偶联核酸?银纳米的探针在检测D?氨基酸的应用，包括如下步骤：按体积比1：1?10的比例：取D?氨基酸水溶液与酶偶联核酸?银纳米探针，混合均匀，37℃恒温30～60min，用荧光分光光度计在激发波长568nm，发射波长为620nm的条件下测定。(1)用本发明的酶偶联核酸?银纳米的探针能对食品中的D?氨基酸进行检测，检测下线可达到10nm；(2)与传统的检测方法相比，样品无需进行衍生化，操作简单、降低成本，实现D?氨基酸的快捷、方便的检测。选择性好、特异性高。
【专利说明】
酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用。
【背景技术】
[0002]氨基酸是蛋白质的基本组成单元，与生命活动密切相关。大部分氨基酸均存在手性对映异构体，L-氨基酸和D-氨基酸(甘氨酸除外)ο绝大多数存在于地球上的生命体均以L-氨基酸合成蛋白质，仅少数细菌细胞内存在L-氨基酸的肽链。虽然D-氨基酸不参与人体蛋白质的合成，但其具有特殊的生理功能，少而适量的D-氨基酸是生命所必需的。过量的D-氨基酸可被D-氨基酸氧化酶消除。否则，D-氨基酸的大量进入，将可能引起生命活动的异常甚至死亡。例如，在肌萎缩性侧索硬化症患者的神经胶质细胞中含浓度较高的D-Ser。因此，手性识别在生命过程中极为重要，在食品中若含有过多的D-氨基酸，一旦吸收进入人体，会对人体产生毒理性。
[0003]目前，手性异构体的分析，尤其是小分子异构体氨基酸的检测仍然较为繁琐。D-氨基酸检测方法主要包括高压液相色谱法，气相色谱法，圆二色谱法，电化学检测法，酶法和微流控芯片法等。但上述方法步骤繁琐、操作复杂、成本高、需要大型设备及专业人员等不足。生化分析中荧光法分析法具有分析灵敏度高、选择性强和使用简便等优点，并且以纳米银为荧光探针检测D-氨基酸的工作尚未报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用。
[0005]本发明的技术方案概述如下:
[0006]酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用，包括如下步骤:
[0007]按体积比1:1-10的比例:取D-氨基酸水溶液与酶偶联核酸-银纳米探针，混合均匀，37°C恒温30?60min，用荧光分光光度计在激发波长568nm，发射波长为620nm的条件下测定。
[0008]所述D-氨基酸为D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，D-丝氨酸，D-缬氨酸，D-亮氨酸，D-异亮氨酸，D-色氨酸，D-精氨酸，D-赖氨酸，D-组氨酸，D-丙氨酸或D-酪氨酸。
[0009]所述酶偶联核酸-银纳米探针，是用下述方法制成:
[0010](I)分别用磷酸盐缓冲溶液为溶剂配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-
3.5mM的硝酸银溶液和配制0.7-3.5mM硼氢化钠溶液；
[0011](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸银溶液，混合均匀，加入4.85mL的磷酸盐缓冲溶液，搅拌15-25min，加入50yL硼氢化钠溶液，搅拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸银和硼氢化钠的摩尔比为:1:7:7；
[0012](3)向步骤(2)获得的液体中加入0.56mL的0.5-5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40μL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震荡混匀;所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mM，pH为 6.8。
[0013]所述寡聚核苷酸序列为5z -CCCTTAATCCCC-3'。
[0014]本发明的优点:
[0015](I)用本发明的酶偶联核酸-银纳米的探针能对食品中的D-氨基酸进行检测，检测下线可达到1nm;
[0016](2)与传统的检测方法相比，样品无需进行衍生化，操作简单、降低成本，实现D-氨基酸的快捷、方便的检测。选择性好、特异性高。
【附图说明】
[0017]图1为酶偶联核酸-银纳米探针的荧光照片；
[0018]图2为酶偶联核酸-银纳米探针荧光光谱图；
[0019]图3为酶偶联核酸-银纳米探针对D-丙氨酸识别的荧光光谱图；
[0020]图4.为酶偶联核酸-银纳米的探针对D-精氨酸识别的荧光光谱图；
[0021 ]图5为酶偶联核酸-银纳米的探针对D-苯丙氨酸识别的荧光光谱图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0023]本发明各实施例所作用的D-氨基酸氧化酶为市售猪肾D-氨基酸氧化酶。
[0024]本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，若在本申请寡聚核苷酸5 ~CCCTTAATCCCC-3 z的基础上进行改进，并与D-氨基酸氧化酶结合用于制备酶偶联核酸-银纳米探针，也属于本发明的范围。
[0025]实施例1
[0026]—种酶偶联核酸-银纳米探针，用下述方法制成:
[0027](I)分别用磷酸盐缓冲溶液为溶剂配制0.3mM寡聚核苷酸溶液，配制2.1mM的硝酸银溶液，和配制2.1mM硼氢化钠溶液；
[0028](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸银溶液，混合均匀，加入4.85mL磷酸盐缓冲溶液，搅拌20min，加入50yL硼氢化钠溶液，搅拌70min;
[0029](3)向步骤(2)获得的液体中加入0.56mL的I.0mM的FeSO4水溶液，加入35yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震荡混匀;所述寡聚核苷酸为5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0030]所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mM，pH为6.8。
[0031 ]酶偶联核酸-银纳米的探针的荧光照片见图1。
[0032]荧光谱图为图2。
[0033]实施例2
[0034]—种酶偶联核酸-银纳米探针，用下述方法制成:
[0035](I)分别用磷酸盐缓冲溶液为溶剂配制0.1mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7mM的硝酸银溶液，和配制0.7mM硼氢化钠溶液；
[0036](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸银溶液，混合均匀，加入4.85mL的磷酸盐缓冲溶液，搅拌15min，加入50yL硼氢化钠溶液，搅拌50min;
[0037](3)向步骤(2)获得的液体中加入0.56mL的0.5mM的FeSO4水溶液，加入25yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震荡混匀;所述寡聚核苷酸为5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0038]所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mM，pH为6.8。
[0039]荧光谱图为图2。
[0040]实施例3
[0041 ] 一种酶偶联核酸-银纳米探针，用下述方法制成:
[0042](I)分别用磷酸盐缓冲溶液为溶剂配制0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制3.5mM的硝酸银溶液，和配制3.5mM硼氢化钠溶液；
[0043](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸银溶液，混合均匀，加入4.85mL的磷酸盐缓冲溶液，搅拌25min，加入50yL硼氢化钠溶液，搅拌90min;
[0044](3)向步骤(2)获得的液体中加入0.56mL的5.0mM的FeSO4水溶液，加入40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震荡混匀;所述寡聚核苷酸为5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0045]所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mM，pH为6.8。
[0046]荧光谱图为图2。
[0047]实施例4
[0048]用实施例1制备的酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用，包括如下步骤:
[0049]在三支离心管中，均加入90yL的酶偶联核酸-银纳米探针，再分别加入1yL的超纯水(空白)，1yL的10—2M的L-丙氨酸和1yL的10—2M的D-丙氨酸，混合均匀，37°C恒温45min，用荧光分光光度计在激发波长568nm，发射波长620nm测定。见图3。
[0050]实施例5
[0051]用实施例2制备的酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用，包括如下步骤:
[0052]在三支离心管中，均加入50yL的酶偶联核酸-银纳米探针，再分别加入50yL的超纯水(空白)，50yL的10—2M的L-精氨酸和50yL的10—2M的D-精氨酸，混合均匀，37 °C恒温30min，用荧光分光光度计在激发波长568nm，发射波长620nm测定。见图4。
[0053]实施例6
[0054]用实施例3制备的酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用，包括如下步骤:
[0055]在三支离心管中，均加入10yL的酶偶联核酸-银纳米探针，再分别加入1yL的超纯水(空白)，1yL的10—2M的L-苯丙氨酸和1yL的10—2M的D-苯丙氨酸，混合均匀，37°C恒温60min，用荧光分光光度计在激发波长568nm，发射波长620nm测定。见图5。
[0056]实施例7，根据实施例4操作流程，依次对下述D-氨基酸进行手性识别:D-脯氨酸，D-丝氨酸，D-缬氨酸，D-亮氨酸，D-异亮氨酸，D-色氨酸，D-赖氨酸，D-组氨酸，D-丙氨酸，D-酪氨酸等。结果相同，酶偶联核酸-银纳米的探针能够有效的对D-氨基酸进行识别。
[0057]实验证明:用本发明的酶偶联核酸-银纳米探针可以对D-丙氨酸，D-精氨酸，D-苯丙氨酸，D-组氨酸，D-赖氨酸，D-丝氨酸，D-苏氨酸等进行检测。
【主权项】
1.酶偶联核酸-银纳米的探针在检测D-氨基酸的应用，其特征是包括如下步骤: 按体积比I: 1-10的比例:取D-氨基酸水溶液与酶偶联核酸-银纳米探针，混合均匀，370C恒温30?60min，用焚光分光光度计在激发波长568nm，发射波长为620nm的条件下测定。2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述D-氨基酸为D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，D-丝氨酸，D-缬氨酸，D-亮氨酸，D-异亮氨酸，D-色氨酸，D-精氨酸，D-赖氨酸，D-组氨酸，D-丙氨酸或D-酪氨酸。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述酶偶联核酸-银纳米探针，是用下述方法制成: (1)分别用磷酸盐缓冲溶液为溶剂配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-3.5mM的硝酸银溶液和配制0.7-3.5mM硼氢化钠溶液； (2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸银溶液，混合均匀，加入4.85mL的磷酸盐缓冲溶液，搅拌15-25min，加入50yL硼氢化钠溶液，搅拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸银和硼氢化钠的摩尔比为:1:7:7; (3)向步骤(2)获得的液体中加入0.56mL的0.5_5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震荡混匀;所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mM，pH为6.8ο4.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述寡聚核苷酸序列为5~CCCTTAATCCCC-3、
【文档编号】G01N21/64GK105987894SQ201610526972
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】仰大勇, 张志昆, 杨璐, 刘阳
【申请人】天津大学