一种通用型抗体-寡核苷酸探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种通用型抗体?寡核苷酸探针及试剂盒，所述通用型抗体?寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分；所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷酸的5'端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述通用型抗体?寡核苷酸探针。所述通用型抗体?寡核苷酸探针中不同的寡核苷酸可以与不同种类的抗体偶联，从而可以进行QPCR，通用的平行检测细胞中的多种相应的抗原，实用性强。
【专利说明】
一种通用型抗体-寡核苷酸探针及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫聚合酶链式反应领域，具体涉及一种通用型抗体-寡核苷酸探针 及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 免疫聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是一种利用抗原抗体 反应的特异性和PCR扩增反应的灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。为了测定某种特 定抗原，必须制备相应的抗体-核苷酸探针。而特定的抗体与核苷酸的交联过程非常复杂， 而且不具有通用性。通常是根据特定的抗体结构，设计特定的交联方式。
[0003] 如申请号为201110315281.6的中国专利，其专利名称为《检测病源细胞的靶向性 分子及其应用》，公开了一种用于靶向性检测病源细胞的试剂盒，其中公开的靶向性分子是 将叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物与寡核苷酸探针通过C-S键偶联得到的。但是该方法仅可得 到叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物可识别的病源细胞，通用性不强，无法实现多重检测的目 的。而一般的细胞检测往往都需要同时检测多个抗原，对一份样品进行反复的操作，不但大 幅增加了工作量，延长了检测周期，增加了失误概率，同时可能带来样品污染的问题，检测 结果的可靠性不高。
[0004] 并且，偶联了寡核苷酸会对抗体的亲和性有影响，使结合了寡核苷酸的抗体特异 性结合的亲和力不高，从而影响检测的准确度。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种通用型抗体-寡核苷酸探针，可对样本的多个表面抗原 进行平行定量检测，并且提高了检测的灵敏度和准确性。
[0006] 本发明的另一个目的是提供含有上述通用型抗体-寡核苷酸探针的试剂盒。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0008] -种通用型抗体-寡核苷酸探针，其特征在于：所述通用型抗体-寡核苷酸探针包 括寡核苷酸探针部分和抗体部分;所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷酸的5 '端进行醛基修 饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所 述抗体部分经过偶联得到所述通用型抗体-寡核苷酸探针。
[0009] 进一步的，所述寡核苷酸的长度为16-22nt，5 '端为6-14nt长度的引物识别序列， 3'端用延伸引物进行延伸扩展。
[00?0]更进一步的，所述延伸引物的长度为50-80nt，它的3 '端末端与寡核苷酸的3 '端互 补配对，5'端可以形成发卡结构。延伸引物的序列优选为SEQ ID N0:14。
[0011] 所述寡核苷酸探针部分是将5 '端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍 的SFB进行醛基修饰后得到的;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼 基修饰后得到的。
[0012] 其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯；上述的SANH是指4-(N-马来 酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
[0013]所述抗体-寡核苷酸探针是将摩尔比为（7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部 分，在室温条件下反应4-24小时后得到的。
[0014]优选的，所述寡核苷酸的序列为SEQ ID N0:1-13中所示的任一个。
[0015] 在本发明的另一方面，提供了一种含有上述通用型抗体-寡核苷酸探针的试剂盒， 所述试剂盒包括：
[0016] 通用型抗体-寡核苷酸探针；
[0017] 用于将通用型抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
[0018] 还包括荧光探针。
[0019] 所述扩增引物中包括一对用于将通用型抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、 反向引物;所述正向引物的5'端与寡核苷酸互补。
[0020] 进一步的，所述试剂盒中还包括延伸引物，所述延伸引物的长度为50-80nt，它的 3 '端末端与寡核苷酸的3 '端互补配对，5 '端可以形成发卡结构。
[0021 ]所述试剂盒中的通用型抗体-寡核苷酸探针为CK19-寡核苷酸探针。
[0022]本发明具有如下有益效果：
[0023] 1.本发明先将寡核苷酸与抗体分别进行定向修饰得到寡核苷酸探针部分和抗体 部分，从而可以避免抗体内部发生交联，使寡核苷酸探针部分和抗体部分的偶联具有高度 特异性，得到的腙键偶联物稳定性好。而且定向修饰及偶联的反应条件温和，不需另外使用 还原剂，抗体不易变性和失活。
[0024] 2.由于抗体-寡核苷酸探针中抗体部分的亲和性在一定程度内会随着寡核苷酸链 长度增加而下降，而发明人发现控制寡核苷酸的长度为16_22nt时，抗体部分的亲和性几乎 不受影响。
[0025] 3.用延伸引物对寡核苷酸的3 '端扩增，可以保证寡核苷酸链过短时的PCR扩增要 求，并且延伸引物5'端的发卡结构可以增加碱基的堆砌力，从而增强探针敏感性，使通用型 抗体-寡核苷酸探针检测更加灵敏。
[0026] 4.由于寡核苷酸与延伸引物是在3'端互补配对的，因此延伸扩展的过程在PCR扩 增过程中可自行反应，延伸扩展之后再以延伸后的抗体-寡核苷酸为模板进行扩增，一步反 应即可，反应效率高。
[0027] 5.本发明所述通用型抗体-寡核苷酸探针中不同的寡核苷酸可以与不同种类的抗 体偶联，从而可以进行多重PCR，通用的平行检测细胞中的多种相应的抗原，实用性强。
【具体实施方式】
[0028] 以下通过具体实施例来进一步说明本发明：
[0029] 本发明要得到通用型抗体-寡核苷酸探针，其是通过先将寡核苷酸与抗体分别进 行醛基和肼基的定向修饰得到寡核苷酸部分和抗体部分，再进行腙键偶联得到。优选的，所 述寡核苷酸探针部分是将5 '端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行 醛基修饰后得到的，优选摩尔当量为10倍;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的 SANH进行肼基修饰后得到的，优选摩尔当量为25倍。其中，SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚 胺酯，SANH为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。用SFB修饰寡核苷酸 的5 '端上的氨基可以得到醛基活化的寡核苷酸，用SANH修饰抗体可以得到肼基活化的抗体 蛋白。这两个反应为公开技术可以得到的，如中国文献"基于核酸分子杂交的免疫芯片抗体 固定新方法"，《分析化学》，2013年第2期，沙莎等公开的。反应时间、反应温度等条件可根据 文献内容做出本领域技术人员公知的调整。本发明优选的技术方案为:将5'端带有氨基修 饰的寡核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，然后与摩尔当量为寡核苷酸10倍的SFB溶液 混合，室温反应2.5小时，再纯化得到醛基修饰的寡核苷酸探针部分。将抗体用pH值为7.4的 PBS缓冲液稀释后，与摩尔当量为抗体25倍的SANH溶液混合，室温反应2.5小时，再纯化得到 肼基修饰的抗体部分。最后将摩尔比为(7-10): 1的寡核苷酸探针部分和抗体部分在室温下 偶联反应得到所述通用型抗体-寡核苷酸探针。
[0030]以下通过实施例1来进行进一步说明，其余未说明的具体条件及实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0031 ]本实施例中所述的"室温"是指常规的室内温度，一般为15_30°C。
[0032] 本实施例将序列为SEQ ID ^):(1-13)的01丨8〇简写为01丨8〇(1-13)，01丨8〇为寡核 苷酸。
[0033]本实施例中的PBS缓冲液为磷酸缓冲液，MES缓冲液为2-(N-吗啉代）乙磺酸缓冲 液。
[0034]本实施例中的QPCR为实时荧光定量PCR。
[0035] 本实施例中的Nanodrop为分光光度计。
[0036] 本实施例中的BCA法是指蛋白质浓度测定的定量方法。
[0037] 本实施例所用的缓冲液为:配置不同pH值的roS缓冲液，在本发明的【具体实施方式】 中，具体包括pH值为6.0的PBS缓冲液，以及pH值为7.4的PBS缓冲液，并且配置pH值为5.0的 MES缓冲液，过滤除菌处理，4 °C存放。
[0038]实施例1CK19-寡核苷酸探针 [0039] (1)寡核苷酸探针的醛基修饰
[0040] 将50nmol的Oligol(寡核苷酸）用0.1M的pH 7.4的磷酸缓冲液配置成溶液。称取 500nmo 1的SFB(4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯），用无水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶解后，在 室温反应2.5h，过柱纯化得到01ig〇-FB(醛基修饰的寡核苷酸）。
[0041 ] 检测01ig〇-FB的浓度：用Nanodrop分光光度计检测A·的值，计算Oligo-FB的浓度 为0·68nmol/yL〇
[0042]检测醛基修饰率：用定量的2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液检测醛基修饰率。取上述 01ig〇-FB加入到2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液中，振荡混匀后于37°C反应lh，用Nanodrop检测 360nm处的吸光值为1 · 41，计算其修饰率，A36Q下的修饰率为0 · 85。
[0043] (2)抗体CK19的肼基修饰
[0044] 对抗体CK19进行脱盐纯化后用Nanodrop检测抗体蛋白浓度为7.9mg/mL。
[0045]用pH值为7.4的磷酸缓冲液稀释抗体CK19至浓度为2mg/mL。称取25倍量的SANH(抗 体与SANH的摩尔比为1:25)，溶解在无水DMF中，再加入到抗体中，在室温反应2.5h，过柱纯 化得到CK19-SANH(肼基修饰的CK19)。
[0046] 检测CK19-SANH的浓度:通过BCA法计算修饰后的CK19-SANH的浓度为1.80mg/mL。
[0047]检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的 抗体-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37°C反应lh，Nanodrop检测 348nm处的吸光值为0.43。通过348nm处的吸光值和CK19-SANH的浓度计算出CK19-SANH的肼 基修饰率为3.7。
[0048] (3)01ig〇-FB 与 CK19-SANH 的偶联
[0049] 将01ig〇-FB与CK19-SANH按照摩尔比7:1混合涡旋混匀，室温反应4h，最后得到的 产物经过过柱纯化后即可得到所述通用型CK19-01igo探针。
[0050] 取CK19_01igo探针进行Nanodrop检测。在354nm下有明显吸收峰出现，说明Oligo- FB与CK19-SANH的偶联成功。
[0051 ] 取CK19-01igo探针进行SDS-PAGE检测，分析CK19与oligo偶联程度，跟纯的CK19比 较，得到多条电泳条带，说明CK19上偶联了不同数量的寡核苷酸。
[0052]取CK19-01igo探针进行BCA法浓度检测。BCA法浓度检测计算偶联物抗体的浓度。 用单链定量试剂盒定量CK19-01igo中Oligol的浓度。可以计算出CK19与Oligol的比例，并 可以和修饰率结果比较。说明了CK19-01igo分子中Oligol与抗体的偶联比，结果如表1所 不。
[0053] 表1 CK19-01igo分子中Oligo与抗体的偶联比 [0054]
[0055] 实施例2 Oligo分子的QPCR扩增检测
[0056]将01igo(l-13)分子分别稀释至108分子数/μL。然后按照表2所示配置QPCR扩增反 应液，得到各自的试剂盒。其中，延伸引物为RT-P，它的3'端末端与寡核苷酸的3'端互补配 对，5 '端可以形成发卡结构，且中间序列与MGB探针(MGty)的序列互补即可，本实施例的RT-P以序列为SEQIDN0:14所示为例。正向引物为FP，反向序列为RP。FP以序列为SEQIDN0 : 15所示为例，RP以序列为SEQ ID N0:16所示为例，MGty以序列为SEQ ID N0:17所示为例，5' 端的荧光基团用FAM标记，3 '端为MGB。
[0057] 表2 Oligo分子的QPCR扩增试剂盒
[0059]然后按照表3的程序对各自的试剂盒分别进行QPCR扩增：
[0060] 表3 QPCR扩增程序
[0062]扩增结果如表4所示：
[0063]表4实施例2扩增结果
[0066] 从表4可以看出，加入了 RT-P后，短链的Oligo也可以进行有效的PCR扩增。这是因 为Oligo会先与RT-P进行延伸扩展，然后再以延伸扩展后的链为模板进行PCR扩增。
[0067]实施例3 Oligo分子的QPCR扩增特异性检测
[0068] 将01ig〇l-13分子稀释至浓度为25000分子数/μ1、83333分子数/μL和250000分子 数AU三个浓度。然后以01igol-3为例，将01ig〇l-3在相同浓度下混合，得到混合样品Α、Β、 C，如表5所不。
[0069] 表5实施例3样品配方
[0070]
[0071] 将上述样品按照表2配置QPCR扩增试剂盒，然后按照表3所示的程序对Oligol-3进 行QPCR扩增，以及对混合样品A、B、C中的01igol-3各自进行QPCR扩增，扩增结果的Ct值如表 6所示。所用的打^?、1^、1?^ 7均与实施例2相同，扩增是以延伸扩展后的0118〇1-3为模 板。
[0072] 表6扩增结果Ct值
[0074]从表6可以看出，混合样品A、B、C中的01igol-3，在相同浓度下扩增的Ct值与单个 Oligo的扩增Ct值为0.1左右。同时，根据每条Oligo的不同浓度样品绘出回归直线，算得回 归直线方程及相关系数R2如下：
[0075] 01igol:y = -3.3664x+40.11，R2 = 0.99937;
[0076] 01igo2：y = -3.384x+40.809,R2 = 0.99997；
[0077] 01ig〇3:y = -3.3824x+38.928，R2 = 0.99463。
[0078] 将每条Oligo对应的A-C号样品根据各个方程进行计算，算得分子数除以对应理论 分子数，所得检测效率如下：
[0080]因此，平行样品间扩增Ct差值为0.1左右，检测效率为98.5 %_110.5%之间，说明 三条Oligo分别与其余两条没有非特异性扩增，相互之间不会影响扩增效率。其余Oligo经 鉴定可以得到同样结果，说明本实验设计的多条Oligo之间无交叉影响，可以保证多重PCR 的特异性、精确性和灵敏度。其他Oligo可以得到同样的结论，由于篇幅原因不一一详细说 明。
[0081 ] 实施例4制作标准曲线
[0082] 按照实施例1的步骤，用摩尔当量为5倍的SFB对01ig〇2进行修饰得到Oligo-FB，用 摩尔当量为10倍的SANH对CK19进行肼基修饰得到CK19-SANH，将摩尔比为10:1的01ig〇-FB 与CK19-SANH在室温条件下反应16小时后得到CK19-01igo2。
[0083] 按照实施例1的步骤，用摩尔当量为20倍的SFB对01igo3进行修饰得到01ig〇-FB， 用摩尔当量为50倍的SANH对CK19进行肼基修饰得到CK19-SANH，将摩尔比为8:1的01ig〇-FB 与CK19-SANH在室温条件下反应24小时后得到CK19-01igo3。
[0084] 将剩余01igo4-13都按照实施例1的步骤，得到CK19-01igo(4-13)。将CK19-01igo (1-13)按照表2的试剂盒和表3的程序进行QPCR扩增，得到的扩增结果与表4 一致，说明 01igol-13与CK19-01igo(l-13)的扩增效率一致，偶联的抗体部分对Oligo的PCR扩增没有 影响。
[0085] 用标准品稀释液将CK19-01 igo 1稀释成浓度为：833、2500、8333、25000、83333和 250000分子个数/2.5μ1，共六个浓度，空白对照组为去离子水。
[0086] 按照表2所示的配方配置PCR扩增试剂盒，然后按照表3所示的程序对以上各浓度 的CK19-01igol以延伸扩展后的Oligol为模板进行QPCR扩增，将扩增结果根据CK19-01igol 的不同浓度，绘出标准曲线，进行线性回归计算，得到回归直线方程及相关系数如下：
[0087] y = -3.3353x+39.193,R2 = 0.99609〇
[0088] 实施例5细胞上抗原数量检测
[0089] 为了计算每个细胞上抗原数量，设计如下实验，以MCF-7细胞上的CK19抗原检测为 例：
[0090] (1)所有1.5mlEP管使用反应缓冲液包被15min。
[0091 ] (2)取新鲜培养的MCF-7细胞，消化后细胞计数，取1*105个细胞离心去上清。移出 上清，400μ1缓冲液重悬后加入100μ1 blocking DNA室温封闭20min;
[0092] (3)加入CK19-01igol探针，室温孵育40min后终止反应并离心去上清。
[0093] (4)使用PBS洗涤细胞3遍后加入120μ1洗脱液混合均匀，冰上孵育2min，离心取100 μL上清，洗脱未反应的CK19-01igol探针;最后加入20yL反应中和液中和。
[0094] (5)用实施例4同样条件进行QPCR扩增来检测步骤(4)得到样品Ct值，对应实施例4 中的标准曲线Ct值即可计算获得样品中CK19-01igol的浓度(分子数）。将测得的总分子数 除以加入的细胞数可得到每个细胞上结合的分子数，结果为总CK19-01igol分子数 157589726.3个，每个细胞上CK19-01igol分子数为1575.9个。
[0095] 实验所得每个细胞上结合的CK19-〇 1 igo分子数与通过western blot方法测定的 数据结果基本相同。
[0096] 实施例6循环肿瘤细胞(CTC)检测的回收率
[0097] 回收率=(平均检出细胞数量-阴性对照品细胞数量)/掺入的细胞数量* 100 % [0098]为了检测循环肿瘤细胞(CTC)检测的回收率，设计如下实验，以MCF-7细胞检测为 例：
[0099] (1)从健康人身上抽取的血液中每3ml中分别掺入0、1、10、50、100个1?^-7细胞，以 掺入0个MCF-7细胞的血液为阴性对照品，然后加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。然 后将样品置于2_8°C冰箱中裂解15min后离心弃上清，加入lOmLPBS洗涤细胞;再离心弃上 清，再加入400yLPBS重悬细胞。
[0100] (2)加入100μΙ blocking buffer室温封闭20min;加入CK19-01igol探针，室温孵 育40min后终止反应并离心去上清。
[0101] (3)使用PBS洗涤细胞3遍后加入120μ1洗脱液混合均匀，冰上孵育2min，离心取100 μL上清;洗脱未反应的CK19-01igol探针;最后加入20yL反应中和液中和。
[0102 ]按标曲计算MCF-7细胞个数，结果如表7所示：
[0103] 表7 CTC检测回收率
[0106] 从表7可以看出，本发明的CK19_01igol探针检测细胞回收率高于磁珠筛选的回收 率，并且灵敏度高。
[0107] 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还 可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
【主权项】
1. 一种通用型抗体-寡核苷酸探针，其特征在于:所述通用型抗体-寡核苷酸探针包括 寡核苷酸探针部分和抗体部分;所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷酸的5'端进行醛基修饰 后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述 抗体部分经过偶联得到所述通用型抗体-寡核苷酸探针。2. 根据权利要求1所述的通用型抗体-寡核苷酸探针，其特征在于:所述寡核苷酸的长 度为16-22nt，5'端为6-14nt长度的引物识别序列，3'端用延伸引物进行延伸扩展。3. 根据权利要求2所述的通用型抗体-寡核苷酸探针，其特征在于:所述延伸引物的长 度为50-80nt，它的3'端末端与寡核苷酸的3'端互补配对，5'端可以形成发卡结构。4. 根据权利要求1所述的通用型抗体-寡核苷酸探针，其特征在于:所述寡核苷酸探针 部分是将5 '端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到 的;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。5. 根据权利要求1所述的通用型抗体-寡核苷酸探针，其特征在于:所述抗体-寡核苷酸 探针是将摩尔比为(7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部分，在室温条件下反应4-24小时 后得到的。6. 根据权利要求1所述的通用型抗体-寡核苷酸探针，其特征在于:所述寡核苷酸的序 列为SEQ ID NO: 1-13中所示的任一个。7. -种含有权利要求1所述通用型抗体-寡核苷酸探针的试剂盒，其特征在于:所述试 剂盒包括： 通用型抗体-寡核苷酸探针； 用于将通用型抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液； 还包括焚光探针。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述扩增引物中包括一对用于将通用型 抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引物;所述正向引物的5'端与寡核苷酸互补。9. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还包括延伸引物，所述延 伸引物的长度为50_80nt，它的3 '端末端与寡核苷酸的3 '端互补配对，5 '端可以形成发卡结 构。10. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中的通用型抗体-寡核苷酸 探针为CK19-寡核苷酸探针。
【文档编号】C12N15/11GK105886500SQ201610206089
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】陈昌岳, 李静, 蔡红东, 邓文斌, 甘广利, 张祥林
【申请人】上海美吉生物医药科技有限公司