抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒包括：抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗滋养层细胞膜抗体的检测这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1U/L，相对于传统的抗滋养层细胞膜抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
【专利说明】
[0001] 抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
[0002] 本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测 试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0003] 不孕不育是当前生殖医学研究的一个热点，近年来随着生殖免疫学研究的发展， 已经认识到免疫因素是引起不孕不育的重要因素之一，免疫性不孕占女性不孕的10%左右， 自身抗体的产生是其重要原因。抗滋养层细胞膜抗体（ATA)是影响不孕不育的自身抗体 之一。抗滋养层细胞膜抗体的产生可影响卵巢和卵泡的发育和功能。所以现在很多不孕不 育症都是由于抗滋养层细胞膜抗体而造成的，所以抗滋养层细胞膜抗体测定对治疗不孕不 育病来说非常重要。
[0004] 目前临床检测抗滋养层细胞膜抗体的常见方法有酶联免疫吸附法、酶促化学发光 法，但这些方法都存在着一些不足之处。
[0005] -、酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法(ELISA)被广泛应用，但该方法也存在着下述的不足之处： ⑴使用12X8型、6X8型、8X12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反 应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单 人份的检测； (2) 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使 用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注 试剂的操作也极为繁琐； (3) 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知 悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大 的随意性； (4) 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影 响检测结果的准确性； (5) 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复 杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差； (6) 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数X 48/96人份，如果需要检 测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10X48/96人份，如果只有一份样本需要检测10 个不同的项目，也需要配置10 X 48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
[0006] 二、化学发光法 化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。
[0007] 酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶两种，但都有一定的局 限性，辣根过氧化物酶主要缺点为:鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H202 氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定， 要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性磷酸酶主要缺点为:底物达到平台期的时 间长，底物成本高，导致检测成本高，患者负担重。
[0008] 吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势，主要表现 在:反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，背景发光低，信噪比高，干扰因 素少，试剂稳定性好，可以两点定标，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且 联结后光子产率不减少。

【发明内容】

[0009] 基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检 测试剂盒及其制备方法。
[0010] -种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括:抗滋养层细胞膜抗体 重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。
[0011] 在一个实施例中，所述抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中， 所述抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白与所述羧基化的磁微粒的比例为1:25~35。
[0012] 在一个实施例中，所述抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中，所述抗人免疫 球蛋白与所述化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0013]在一个实施例中，所述羧基化的磁微粒的粒径为〇.〇5ym~lym。
[0014] 在一个实施例中，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶 酯。
[0015] 在一个实施例中，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
[0016] 在一个实施例中，所述A液为H2〇2溶液，所述B液为NaOH溶液。
[0017] 在一个实施例中，还包括抗滋养层细胞膜抗体定标品。
[0018] 在一个实施例中，所述抗滋养层细胞膜抗体定标品为浓度分别为1U/U10U/L、 100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L的抗滋养层细胞膜抗体的溶液。
[0019] -种上述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下 步骤： 取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白，室温下混悬2h~ l〇h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基 化的磁微粒；以及 取抗人免疫球蛋白，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温 下避光反应lh~2h后除杂，得到抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。
[0020] 这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫 分析仪为检测工具，完成抗滋养层细胞膜抗体的检测这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免 疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1U/L，相对于传统的抗滋养层细胞膜抗体的检 测方法灵敏度至少提高了 10倍，这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测 精度较高。
[0021]
【附图说明】
[0022] 图1为一实施方式的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的 流程图； 图2为实施例3得到的抗滋养层细胞膜抗体标准曲线图。
[0023]
【具体实施方式】
[0024] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于 充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术 人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施 的限制。
[0025] -实施方式的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括:抗滋养层细 胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。 [0026]优选的，抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中，抗滋养层细胞 膜抗体重组蛋白与羧基化的磁微粒的比例为1:25~35。
[0027]优选的，抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中，抗人免疫球蛋白与化学发光 标记物的比例为50:1~10。
[0028] 优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05wii~lym。
[0029] 化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光 标记物优选为吖啶酯。
[0030] 在其他的实施例中，上述抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括化 学发光底物液。
[0031] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H202溶液，B液可以为NaOH溶液。
[0032] 本实施例中，A液为浓度为0. lmol/L的H202溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0033]在其他的实施例中，上述抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括抗 滋养层细胞膜抗体定标品。
[0034] 抗滋养层细胞膜抗体定标品为浓度分别为1U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L 和2000U/L的抗滋养层细胞膜抗体的溶液。
[0035] 具体的，抗滋养层细胞膜抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗滋养层细胞膜抗 体配制成浓度分别为11]/1、101]/1、1001]/1、5001]/1、10001]/1和20001]/1的抗滋养层细胞膜抗 体的溶液。
[0036] 这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒用于抗滋养层细胞膜抗体检 测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对抗滋养层细胞膜抗体定标品进行检测，绘制标准 曲线，内置于电脑软件;接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度;最后对抗滋养 层细胞膜抗体全自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评 价。
[0037]这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫 分析仪为检测工具，完成抗滋养层细胞膜抗体的检测这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免 疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1U/L，相对于传统的抗滋养层细胞膜抗体的检 测方法灵敏度至少提高了 10倍，这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测 精度较高。
[0038]此外，这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点： 1、 选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化 学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本； 2、 选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到1U/L~1000U/L，而传统的 抗滋养层细胞膜抗体的检测方法的检线性范围为20U/L~1000U/L; 3、 吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学 发光免疫分析系统难以达到的； 4、 化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测 试样本就可直接得到样本的浓度值； 5、 化学发光免疫分析系统可以实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作 更加简便，减少了人为的误差。
[0039] 如图1所示的上述抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包 括如下步骤： 取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白，室温下混悬2h~ l〇h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基 化的磁微粒。
[0040] MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液的浓度为0.02M，pH为5.5。
[0041 ] Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2%BSA，pH为8.0。
[0042] EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺）水溶液的浓度为10mg/mL~20mg/ mL，EDC与羧基化的磁微粒的比例为0.05:0.1~1。
[0043]优选的，抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中，抗滋养层细胞 膜抗体重组蛋白与羧基化的磁微粒的比例为1:25~35。
[0044]优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05wii~lwii。
[0045]取抗人免疫球蛋白，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀， 室温下避光反应lh~2h后除杂，得到抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。
[0046] 碳酸盐缓冲液浓度为0 ? lM，pH为9 ? 0~9 ? 5， 除杂的操作为离心脱盐柱脱盐，具体操作为：先分别用纯净水及TBS缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0)处理离心脱盐柱，最后加入得到的抗滋养层细胞膜 抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集离心管中的液体。
[0047] 优选的，抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中，抗滋养层细胞膜抗体重组蛋 白与化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0048] 化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光 标记物优选为吖啶酯。
[0049] 得到的抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白 标记的化学发光标记物组合即可得到上述抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒。
[0050] 这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒在使用时，还需要化学发光底 物液和抗滋养层细胞膜抗体定标品。
[0051 ]化学发光底物液和抗滋养层细胞膜抗体定标品可以自行配制得到。
[0052] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H202溶液，B液可以为NaOH溶液。
[0053] 本实施例中，A液为浓度为0. lmol/L的H2〇2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0054]具体的，抗滋养层细胞膜抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗滋养层细胞膜抗 体配制成浓度分别为11]/1、101]/1、1001]/1、5001]/1、10001]/1和20001]/1的抗滋养层细胞膜抗 体的溶液。
[0055] 这种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便，制得的 抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
[0056] 以下为具体实施例。
[0057] 实施例1:抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备 (1)抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒的制备： 取含有50mg粒径为0.05M1~lym的羧基化的磁微粒(MagnaBind21353)悬浮液，磁分离去 上清，用0.02 M，pH为5.5 MES缓冲液重悬，加入lmL新配置的1 Omg/mL的EDC水溶液，活化磁 珠表面羧基，加入4mg抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白（biorbyt，货号orb48780)，室温下混悬 6h，磁分离，去除上清，用含2%BSA的0.1M，pH为8.0的Tris缓冲液重悬到lmg/mL，得到抗滋养 层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0058] (2)抗人免疫球蛋白标记的吖啶酯的制备： 取50yL浓度为25mg/mL的抗人免疫球蛋白，加入150yL浓度为0. lM、pH为9.0~9.5的碳酸 盐缓冲液，混匀，然后加入1.5yL浓度为5mg/mL的吖啶酯溶液混匀，室温下避光反应，1.5h后 取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行 处理，最后加入得到的抗人免疫球蛋白标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管 得到抗人免疫球蛋白标记的吖啶酯，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0059 ] (3 )抗滋养层细胞膜抗体定标品的制备： 用标准品缓冲液(40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0)将抗滋养层细胞膜抗 体配置成浓度为0U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L，每瓶0 ? 5 mL分装冻干，4 °C保存备用。
[0060] 实施例2:抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测方法 以全自动化学发光免疫分析仪(YHL0,货号iFlash3000)为检测工具，方法学模式为间 接免疫法，即仪器依次加入50此的样品、50此的抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧 基化的磁微粒以及50 yL的抗滋养层细胞膜抗体处理液，反应20 min后，再加50 yL的抗人 免疫球蛋白吖啶酯，反应20 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发 光底物A液(H2〇2)及B液(NaOH)进行发光反应，最后记录发光值。
[0061] 实施例3:抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒性能评价 采用实施例2中的方法对抗滋养层细胞膜抗体定标品进行检测，得到绘制标准曲线如 图2所示。
[0062]接着对接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
[0063]灵敏度的检测： 参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试 剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为1U/L。
[0064]线性的检测： 对浓度为1U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L标准品做线性分析，计算线 性相关系数，r=0.9996,另外，该试剂盒对抗滋养层细胞膜抗体样品检测的线性范围为1U/L ~1000U/L。
[0065]精密度测定： 取浓度为50U/L及500U/L两个抗滋养层细胞膜抗体样品，每个样本每个浓度各做3个平 行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均 小于5%。
[0066] 干扰性实验： 取混合血清分别添加干扰物包括:结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油 酯，添加比例按照1:20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值， 计算二者之间的偏差，以±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件标 准，可用于临床实验室抗滋养层细胞膜抗体状况的准确评估。
[0067] 实施例4、抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒的对比实验 分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0、50U/L的抗滋养层细胞 膜抗体样品做检测，两种方法检测灵敏度相比，数据如下表所示：
由上表可以看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了 10倍以上。
[0068] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括:抗滋养层细 胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。2. 根据权利要求1所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中，所述抗滋养层细胞膜抗体重 组蛋白与所述羧基化的磁微粒的比例为1:25~35。3. 根据权利要求1所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中，所述抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白与所述 化学发光标记物的比例为50:1~10。4. 根据权利要求1所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述羧基化的磁微粒的粒径为〇. 05μηι~Ιμπι。5. 根据权利要求1所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。6. 根据权利要求1所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。7. 根据权利要求6所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。8. 根据权利要求1所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 还包括抗滋养层细胞膜抗体定标品。9. 根据权利要求8所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述抗滋养层细胞膜抗体定标品为浓度分别为1U/L、10U/L、100U/U500U/L、1000U/L和 2000U/L的抗滋养层细胞膜抗体的溶液。10. -种根据权利要求1~9中任一项所述的抗滋养层细胞膜抗体化学发光免疫检测试 剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白，室温下混悬2h~ l〇h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗滋养层细胞膜抗体重组蛋白包被的羧基 化的磁微粒；以及取抗人免疫球蛋白，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物 后混匀，室温下避光反应Ih~2h后除杂，得到抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。
【文档编号】G01N21/76GK105928928SQ201610506958
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】邓爱凤, 代洪飞, 夏福臻, 钱纯亘, 王刚
【申请人】深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司