农药残留快速检测点卡及采用该检测点卡检测农残含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种农药残留快速检测点卡，包括长条形扁平薄壳状卡体，卡体由卡座和扣合在卡座上的卡盖组成，卡座上间隔排列有多个检测孔，检测孔内自下而上依次叠放有底物膜和酶膜；卡盖由左卡盖和右卡盖组成，在左卡盖上开设有与卡座最左侧的检测孔相对应的对照品加样孔，在右卡盖上开设有与其他检测孔位置分别相对应的多个加样孔；底物膜由滤纸膜、玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜在吲哚乙酸酯中充分浸泡并经冷冻抽干后制成；酶膜由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜在乙酰胆碱酯酶液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成。本发明提供的农药残留快速检测点卡使用方便，检测灵敏度更高，可以满足现有国家标准的限量要求，在实际中具有较大的应用潜力。
【专利说明】
农药残留快速检测点卡及采用该检测点卡检测农残含量的 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及对蔬菜、水果、粮食、饮用水及土壤中农药残留的检测，尤其是涉及一 种农药残留快速检测点卡，本发明还涉及采用该检测点卡检测果蔬中农残含量的方法。
【背景技术】
[0002] 随着社会进步和人们生活水平的提高，食品安全问题越来越引起人们的重视，随 着环境污染的加剧，果蔬的病虫害也越来越重，绝大部分果蔬需要连续多次施药后才能成 熟上市，农药的广泛使用以及水果蔬菜中农药的残留时刻威胁着食品安全、生态环境和人 类的健康。尤其是有机磷和氨基甲酸酯类农药的广泛应用，阻碍了了农业生产的进步并且 影响了公共卫生中许多疫病的控制。所以，许多国际组织和国家政府严格的限制了果蔬中 农药残留含量，以保证食品安全。
[0003] 检测果蔬中农残含量的方法较多，近几年发展的也很快。目前市场上对有机磷和 氨基甲酸酯类农药在果蔬中残留量的快速检测方法运用较为广泛的是速测卡法，但是此方 法需要用药片沾取待测样品的提取液预反应10分钟，对温度、湿度的控制要求严格;同时在 药片与药片相互反应时，依赖人工操作使折叠酶片与底物片反应，既要求严格又操作繁琐， 对操作人员的专业知识有一定要求，并且仅限于在专业实验室内进行，满足不了现场对果 蔬中农药残留量的快速检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种结构简单、操作简便快速、结果准确的农药残留快速 检测点卡的制备方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的农药残留快速检测点卡，包括长条形扁平薄壳状卡体，所述卡体由卡座 和扣合在所述卡座上的卡盖组成，所述卡座上间隔排列有多个检测孔，所述检测孔内自下 而上依次叠放有底物膜和酶膜;所述卡盖由左卡盖和右卡盖组成，在所述左卡盖上开设有 与所述卡座最左侧的检测孔相对应的对照品加样孔，在所述右卡盖上开设有与其他检测孔 位置分别相对应的多个加样孔;所述底物膜由滤纸膜、玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜在50~ 1 OOmM的吲哚乙酸酯中充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.1~0.3mm，直径5~8mm;所 述酶膜由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜在乙酰胆碱酯酶液中经充分浸泡并经冷冻 抽干后制成，其厚度为0.3~0.5mm，直径5~8mm。
[0006] 所述底物膜优选采用聚酯纤维素膜，所述酶膜优选采用玻璃纤维素膜。
[0007] 采用本发明的检测点卡检测果蔬中农残含量的方法为： 第一步，抽取待测样本，按一定比例稀释成多个样本液后待用； 第二步，从左卡盖上开设的对照品加样孔向下方的检测孔中滴加对照纯净水，该检测 孔作为检测对照孔;从右卡盖上开设的其他加样孔向下方的检测孔中依次滴加稀释后的不 同样本液； 第三步，15~20分钟后肉眼观察各检测孔中颜色变化并与检测对照孔进行比对，直接判 读结果即可。
[0008] 该反应温度为20~30°C条件下进行效果更好。
[0009] 本发明提供的农药残留快速检测点卡能够简单快速的直接将待检测液通过加样 孔滴加到检测孔中，利用渗透作用，促使反应液与酶、底物依次发生反应，从而通过测试卡 的颜色变化，直观的显示被测样品的农药残留情况，可广泛应用于蔬菜、水果、粮食、水及土 壤中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的定性快速测试。本发明的检测点卡易于制备且 节省检测费用，使用简单可靠又方便快捷，无需特殊的仪器设备，不用要求检测人员专业水 平，可以随时随地用于现场中果蔬农残含量的检测；由于样本量需要少，简便快速，也可适 用于大量样本的筛查，结果准确，灵敏度高，准确率大。
[0010] 本发明采用的技术原理是酶的抑制率法。通过加样孔向检测孔内滴加待检测样品 液，使酶膜上的乙酰胆碱酯酶快速溶解到待检测样品液中，若待检测样品不含农药残留，， 混合酶液会缓慢的渗入底物膜，与无色底物吲哚乙酸酯发生颜色反应，底物水解产物吲哚 酚自氧化产生靛蓝色，适合作为肉眼观察检测结果的显色剂。若待检样品含有残留农药时， 可一定程度的抑制其活性，酶膜上的乙酰胆碱酯酶溶于水后，活性受到一定的影响，底物水 解不充分或不水解，颜色变浅蓝色或无色。反应结果在15~20分钟后观察，可通过颜色强度 分析软件对其颜色进行理论分析。
[0011] 因此，本发明提供的农药残留快速检测点卡使用方便，检测灵敏度更高，可以满足 现有国家标准的限量要求，在实际中具有较大的应用潜力。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明的结构示意图。
[0013]图2是图1中卡座的结构示意图。
[0014]图3是图1中卡盖的结构示意图。
[0015]图4是两种材料膜片的显色反应效果对比。
[0016]图5是底物浓度对显色反应的影响。
[0017]图6是温度对显色反应的影响。
[0018]图7是时间对显色反应的影响。
[0019] 图8、图9为检测实例1的反应结果图。
[0020] 图10、图11为检测实例2的反应结果图。
[0021] 图12、图13检测实例3的反应结果图。
【具体实施方式】
[0022] 如图1-3所示，本发明所述的农药残留快速检测点卡，包括长条形扁平薄壳状的卡 体(一般情况下，卡体的长为60~70mm，宽为15~28mm，厚为5~6mm，壁厚为1mm，由工程塑料制 成，实际制造时，可根据测试样品的多少改变卡体的大小），卡体由卡座1和通过定位柱9扣 合在卡座1上的卡盖组成，卡座1上间隔排列有多个(图中显示四个)检测孔2,检测孔内自下 而上依次叠放有底物膜3和酶膜4;卡盖由左卡盖5和右卡盖6组成，在左卡盖5上开设有与卡 座1最左侧的检测孔相对应的对照品加样孔7,在右卡盖6上开设有与其他三个检测孔2位置 分别相对应的三个加样孔8;底物膜3由滤纸膜、玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜(优选为聚酯 纤维素膜）在50~lOOmM的吲哚乙酸酯中充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.1~ 0.3mm，直径5~8mm;酶膜4由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜(优选为玻璃纤维素膜） 在乙酰胆碱酯酶液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.3~0.5mm，直径5~8mm。
[0023]采用本发明的检测点卡检测果蔬中农残含量的方法如下： 第一步，抽取待测样本，按一定比例稀释成多个样本液后待用； 第二步，从左卡盖5上开设的对照品加样孔7向下方的检测孔中滴加对照纯净水，该检 测孔作为检测对照孔，从右卡盖6上开设的其他加样孔向下方的检测孔中依次滴加稀释后 的不同样本液； 第三步，20~30°C条件下，15~20分钟后肉眼观察其他检测孔中颜色变化并与检测对照 孔进行比对，直接判读结果即可。
[0024]其反应结果有以下四种情况： a、当检测孔和对照孔同时显示蓝绿色，表示检测结果为阳性，说明该检测样品农残含 量在安全范围内。
[0025] b、当检测孔不显示颜色，对照孔显示蓝绿色，检测结果为阴性，说明该检测样品农 残含量超标。
[0026] c、当检测孔显示浅蓝绿色，对照孔显示蓝绿色，检测结果为阳性，说明该检测样品 含有一定量农残，但含量不超标。
[0027] d、当检测孔和对照孔均不显色，则表明检测点卡已失效。
[0028]下面通过具体实施例对本发明进行更加详细的介绍 一、本发明反应条件的优化 底物膜和酶膜的确定：由于各种材料的膜性能不同，而酶膜和底物膜材料的选择在本 发明中有着非常重要的作用，对此
【申请人】选择了两种不同材料的膜片进行试验:如玻璃纤 维素膜(GF)和聚酯纤维素膜(PF)。首先，将GF和PF膜均切成直径为6mm的圆形片，分别在酶 液和底物液中进行充分浸泡，待膜片干燥后，分别放置在检测卡孔中，滴加40此水进行反 应，15~20分钟后，从显色反应的结果可以肉眼看出（如图4所示），A:酶片、底物片均为GF;B: 酶片为PF，底物片为GF; C:酶片、底物片均为PF; D:酶片为GF，底物片为PF。结果显示酶膜偏 于GF膜，而底物膜比较偏向于PF。
[0029] 底物吲哚乙酸酯溶解于甲醇中，分别在甲醇的稀释下调整浓度为1 OmM，50mM，， 1 OOmM，200mM，进行试验验证，结果显示（如图5所示），当底物浓度大于50mM时，反应结果差 距不明显。这是由于甲醇属于有机溶液，容易影响酶的活性，对此
【申请人】选用的底物浓度为 50~100mM 〇
[0030] 反应温度的不同对整个反应的影响作用很大，因此
【申请人】在三个不同的温度条件 下进行反应实验，以探讨反应的最佳温度。将底物膜片、酶膜片分别放置检测卡孔中，滴加 40yL水后，将检测卡分别放置在4°C、10°C、20°C、30°C下，15min后进行颜色比对分析。结果 显示(如图6所示），在20°030°(：的条件下，反应结果较佳。
[0031] 由于酶与底物的反应是逐步完成的，因此在反应时间的处理上
【申请人】仍然进行了 最佳时间的优化试验。
【申请人】分别检测在反应时间为5min、1〇111；[11、151]1；[11、201]1；[11的颜色变 化。结果显示（如图7所示），15min后颜色强度的增加不明显，因此，本申请设定的最佳反应 时间为15~20min。
[0032]二、下面选择三种常用的农药辛硫磷、杀扑磷、乙酰甲胺磷样品按本发明方法进行 检测试验 检测实例1 第一步，采用常规方法，配制4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液和0.05yg/mL、0. lyg/mL、0.5y g/mL三个浓度的辛硫磷样品液； 第二步，将聚酯纤维素底物膜和玻璃纤维素酶膜制成直径8mm、厚度0.1mm的圆形膜片； 将底物膜在50mM的吲哚乙酸酯溶液中浸泡，酶膜在4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液中浸泡，经 过充分浸泡后将其分别冷冻抽干10~30分钟，用镊子依次夹取底物膜和酶膜放置在本申请 检测点卡的检测孔内，盖上卡盖备用； 第三步，在左卡盖5上开设的对照品加样孔7向下方的检测孔中滴加对照纯净水作为检 测对照孔，从右卡盖6上开设的三个加样孔向下方的检测孔中依次滴加稀释后的三个辛硫 磷样本液;纯净水和样本液的滴加量根据检测孔的大小决定，一般为2〇-l〇〇ul即可； 第三步，15~20分钟后肉眼观察:检测对照孔内酶膜上的乙酰胆碱酯酶可快速溶于纯净 水，并进一步渗透到下面的底物膜上，与底物发生颜色反应，对照孔显示蓝绿色，滴加0.05ix g/mL、0. lyg/mL、0.5yg/mL三个浓度的辛硫磷样品液的检测孔的颜色从蓝绿色依次递浅，如 图8、图9所示，检测孔显示蓝绿色，颜色强度与对照比<50%，表示检测结果为阳性，说明该 检测样品中虽含有0.05iig/mL的辛硫磷，但含量在安全范围内；检测孔显示浅蓝绿色，颜色 强度与对照比<50%，表面检测结果为阳性，说明该检测样品中虽含有O.lyg/mL的辛硫磷， 含量不完全超标;检测孔不显示颜色，颜色强度与对照比>50%，表示检测结果为阴性，说明 该检测样品中含有〇. 5iig/mL的辛硫磷，含量完全超标;如果检测对照孔和检测孔均不显色， 则表面该检测点卡已失效。
[0033] 检测实例2 第一步，采用常规方法，配制4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液和0. lyg/mL、0.5yg/mL、1.0y g/mL三个浓度的杀扑磷样品液； 第二步，将聚酯纤维素底物膜和玻璃纤维素酶膜制成直径6mm、厚度0.3mm的圆形膜片； 将底物膜在80mM的吲哚乙酸酯溶液中浸泡，酶膜在4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液中浸泡，经 过充分浸泡后将其分别冷冻抽干10~30分钟，用镊子依次夹取底物膜和酶膜放置在本申请 检测点卡的检测孔内，盖上卡盖备用； 第三步，在左卡盖5上开设的对照品加样孔7向下方的检测孔中滴加对照纯净水作为检 测对照孔，从右卡盖6上开设的三个加样孔向下方的检测孔中依次滴加稀释后的三个杀扑 磷样本液;纯净水和样本液的滴加量根据检测孔的大小决定，一般为2〇-l〇〇ul即可； 第三步，15~20分钟后肉眼观察:检测对照孔内酶膜上的乙酰胆碱酯酶可快速溶于纯净 水，并进一步渗透到下面的底物膜上，与底物发生颜色反应，对照孔显示蓝绿色，滴加〇. ly g/mL、0.5yg/mL、1. Oyg/mL三个浓度的杀扑磷样品液的检测孔的颜色从蓝绿色依次递浅，如 图10、图11所示，检测孔显示蓝绿色，颜色强度与对照比<50%，表示检测结果为阳性，说明 该检测样品中虽含有〇. lyg/mL的杀扑磷，但含量在安全范围内；检测孔显示浅蓝绿色，颜色 强度与对照比<50%，表面检测结果为阳性，说明该检测样品中虽含有0.5iig/mL的杀扑磷， 含量不完全超标;检测孔不显示颜色，颜色强度与对照比>50%，表示检测结果为阴性，说明 该检测样品中含有1. 〇yg/mL的杀扑磷，含量完全超标;如果检测对照孔和检测孔均不显色， 则表面该检测点卡已失效。
[0034] 检测实例3 第一步，采用常规方法，配制4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液和0. lyg/mL、0.5yg/mL、1. Oy g/mL三个浓度的乙酰甲胺磷样品液； 第二步，将聚酯纤维素底物膜和玻璃纤维素酶膜制成直径5mm、厚度0.5mm的圆形膜片； 将底物膜在1〇〇禮的吲哚乙酸酯溶液中浸泡，酶膜在4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液中浸泡，经 过充分浸泡后将其分别冷冻抽干10~30分钟，用镊子依次夹取底物膜和酶膜放置在本申请 检测点卡的检测孔内，盖上卡盖备用； 第三步，在左卡盖5上开设的对照品加样孔7向下方的检测孔中滴加对照纯净水作为检 测对照孔，从右卡盖6上开设的三个加样孔向下方的检测孔中依次滴加稀释后的三个乙酰 甲胺磷样本液;纯净水和样本液的滴加量根据检测孔的大小决定，一般为20-100ul即可； 第三步，15~20分钟后肉眼观察:检测对照孔内酶膜上的乙酰胆碱酯酶可快速溶于纯净 水，并进一步渗透到下面的底物膜上，与底物发生颜色反应，对照孔显示蓝绿色，滴加0. ly g/mL、0.5iig/mL、1.0iig/mL三个浓度的乙酰甲胺磷样品液的检测孔的颜色从蓝绿色依次递 浅，如图12、图13所示，检测孔显示蓝绿色，颜色强度与对照比<50%，表示检测结果为阳性， 说明该检测样品中虽含有0.1yg/mL的乙酰甲胺磷，但含量在安全范围内；检测孔显示浅蓝 绿色，颜色强度与对照比<50%，表面检测结果为阳性，说明该检测样品中虽含有0.5iig/mL 的乙酰甲胺磷，含量不完全超标;检测孔不显示颜色，颜色强度与对照比>50%，表示检测结 果为阴性，说明该检测样品中含有l.〇yg/mL的乙酰甲胺磷，含量完全超标;如果检测对照孔 和检测孔均不显色，则表面该检测点卡已失效。
[0035]三、将第二步检测的农药辛硫磷、杀扑磷、乙酰甲胺磷与传统检测方法进行对比， 其结果见下表。
[0036]从上表中可以看出，本发明的农药残留快速检测点卡可以检测处较低的检出限制 (L0D)，即对农药的检测更为敏感。同时本发明的检测方法对农药残留的检测更为简单和迅 速，并且可以在日常生活中随时随地的使用。
【主权项】
1. 一种农药残留快速检测点卡，包括长条形扁平薄壳状卡体，所述卡体由卡座（1)和扣 合在所述卡座（1)上的卡盖组成，其特征在于:所述卡座（1)上间隔排列有多个检测孔(2)， 所述检测孔内自下而上依次叠放有底物膜(3)和酶膜(4);所述卡盖由左卡盖(5)和右卡盖 (6)组成，在所述左卡盖(5)上开设有与所述卡座（1)最左侧的检测孔相对应的对照品加样 孔(7)，在所述右卡盖(6)上开设有与其他检测孔(2)位置分别相对应的多个加样孔(8);所 述底物膜(3)由滤纸膜、玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜在50~IOOmM的吲哚乙酸酯中充分浸 泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.1~0.3mm，直径5~8mm;所述酶膜⑷由滤纸膜、聚酯纤维 素膜或玻璃纤维素膜在乙酰胆碱酯酶液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.3~ 0.5mm，直径 5~8mm 〇2. 根据权利要求1所述的农药残留快速检测点卡，其特征在于:所述底物膜(3)为聚酯 纤维素膜，所述酶膜(4)为玻璃纤维素膜。3. 采用权利要求1的检测点卡检测果蔬中农残含量的方法，包括下述步骤： 第一步，抽取待测样本，按一定比例稀释成多个样本液后待用； 第二步，从左卡盖(5)上开设的对照品加样孔(7)向下方的检测孔中滴加对照纯净水， 该检测孔作为检测对照孔;从右卡盖(6)上开设的其他加样孔向下方的检测孔中依次滴加 稀释后的不同样本液； 第三步，15~20分钟后肉眼观察各检测孔中颜色变化并与检测对照孔进行比对，直接判 读结果即可。4. 根据权利要求3所述检测果蔬中农残含量的方法，其特征在于:第三步中的反应温度 为 20~30°C。
【文档编号】G01N21/78GK105928929SQ201610246230
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】翁海波, 孙召伟, 田柳杨, 李倩
【申请人】郑州大学