一种农药残留检测方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及快速检测食品安全领域，尤其涉及一种农药残留检测方法及检测试剂盒；方法包括以下步骤：S1、包埋：将丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶包埋至多孔基底中制成酶基底；S2、样品制备：将待检样品与缓冲液混匀，得到样品溶液；S3、检测：将样品溶液添加至酶基底孵育，随后再加入乙酰胆碱酯酶底物孵育一段时间，然后采用pH法、电位滴定法、测压法或比色法检测得到待检样品中的农药残留结果；试剂盒包括包埋有丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶的多孔基底、缓冲液以及乙酰胆碱酯酶底物溶液；本发明的农药残留检测方法及检测试剂盒，用于检测有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂、检测成本低、稳定性好、灵敏度高。
【专利说明】
一种农药残留检测方法及检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及快速检测食品安全领域，尤其涉及一种农药残留检测方法及检测试剂合
ΙΤΓΤ.0
【背景技术】
[0002]我国是农药生产、使用大国，农产品中农药残留问题十分严重，这不仅影响了我国食品出口贸易，也对人体健康和生态环境构成巨大威胁。其中，有机磷(OPs)及氨基甲酸酯(CBs)类杀虫剂作为昆虫神经系统中乙酰胆碱酯酶的专一性抑制剂被筛选出来，运用广泛，占杀虫剂用量的70%以上。鉴于农药的剧毒性及其对环境和人类健康的巨大威胁，发展高灵敏度和高准确性的农药残留检测方法尤为重要。
[0003]传统的农药残留检测方法如高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)等均存在仪器设备昂贵、样品前处理过程复杂、要求专业技术人员操作和分析时间长等缺点，不适合于农药残留的大规模检测和现场实时分析。同样小型便携式农药残留检测仪，虽降低了仪器成本、简化了操作过程，仍不合适田间或蔬菜批发市场实时分析。因此，发展一种简便、快速和经济的高灵敏度、高准确性检测方法才能满足现场检测的需求。
[0004]酶抑制检测法能够在较短的时间内检测出OPs和CBs类农药在果蔬中的残留量，其通过逆向思维来检测OPs和CBs类农药。乙酰胆碱酯酶可将乙酰胆碱催化分解为胆碱和乙酸，该产物可使显色剂显色，而OPs和CBs类农药是乙酰胆碱酯酶的底物乙酰胆碱的结构类似物，因此，可以用乙酰胆碱酯酶的活性来探测样品中是否存在这两类化合物；当样品中存在OPs和CBs类农药时，它们会使乙酰胆碱酯酶催化中心中的丝氨酸残基中的羟基发生磷酸化和甲胺酰化，使乙酰胆碱酯酶彻底失去水解底物乙酰胆碱的能力。在酶反应实验中加入底物和显色剂观察颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化，可判断是否存在OPs和CBs类农药残留。
[0005]利用前述特性，用滤纸片作为载体，将乙酰胆碱酯酶吸附其上制成的农药残留快速检测试纸条或测试卡，成为一种用于农药残留现场快速检测的方法，其是将乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱类似物2，6_ 二氧靛酚乙酸醋分别固定在滤纸上，如果样品中不包含OPs和CBs类农药，则2，6_ 二氧靛酚乙酸醋在酶的催化下生成蓝色靛酚。但是，现有的农药残留的现场检测方法存在缺陷，主要是现有方法使用的工具酶价格昂贵，使用后无法回收，此外，无论游离还是固定化工具酶需低温储存和运输，导致检测成本高。
【发明内容】
[0006]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于检测有机磷(OPs)及氨基甲酸酯(CBs)类杀虫剂、检测成本低、稳定性好、灵敏度高的农药残留检测方法及检测试剂盒。
[0007]本发明第一方面提供一种农药残留检测方法，包括以下步骤:
[0008]S1、包埋:将丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶包埋至多孔基底中制成酶基底；
[0009]S2、样品制备:将待检样品与缓冲液混匀，得到样品溶液；
[0010]S3、检测:将样品溶液添加至酶基底孵育，随后再加入乙酰胆碱酯酶底物孵育一段时间，然后采用PH法、电位滴定法、测压法或比色法检测得到待检样品中的农药残留结果；
[0011]其中，若采用pH法检测，则多孔基底中还含有pH指示剂;若采用电位滴定法，则还包括将孵育产物进行电位滴定的步骤;若采用测压法，则还包括测量孵育产物与碳酸氢钠作用所放出CO2气体的压力的步骤;若采用比色法，则还包括向孵育产物中添加乙酰胆碱酯酶底物水解产物的显色剂的步骤。
[0012]丝素蛋白是一种独特的生物高分子，具有由大的疏水性区域和小的亲水间隙构成的嵌段共聚物结构，丝素蛋白制作成的丝素蛋白膜在不同温度和湿度条件下非常稳定，而且机械性很强，在生物实验中可作为包埋基质，保护其他蛋白质的生物活性，利用这一特点来包埋乙酰胆碱酯酶，极大的保护了酶的活性，稳定易储存、且检测精密度高。
[0013]本发明所指的多孔基底，其作用在于，通过具有较高比表面积的多孔结构来支撑和吸附丝素蛋白，形成包埋基质，以进一步包埋乙酰胆碱酯酶，保护其活性。多孔基底的种类应当包括但不限于多孔膜、多孔非织造网、多孔纤维、发泡件等，可包含一种或多种聚合物材料或天然纤维。
[0014]所述聚合物材料可包括(但不限于)聚烯烃、聚(异戊二烯)、聚(丁二烯)、氟化聚合物、氯化聚合物、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚、聚(醚砜)、聚砜、聚苯醚、聚(乙酸乙烯酯)、乙酸乙烯酯的共聚物、聚磷腈、聚(乙烯基酯)、聚(乙烯基醚)、聚(乙烯醇)以及聚(碳酸酯)。
[0015]所述天然纤维包括植物纤维、动物纤维、人造纤维、无机纤维等。其中，植物纤维主要组成物质是纤维素，是由植物上种籽、果实、茎、叶等处获得的纤维;动物纤维主要组成物质是蛋白质，分为毛和腺分泌物两类;人造纤维为用纤维素、蛋白质等天然高分子物质为原料，经化学加工、纺丝、后处理而制得的纺织纤维;无机纤维是以矿物质为原料制成的纤维，如玻璃纤维、金属纤维等。
[0016]合适的多孔基底可能具有各种形状和大小，如膜状、纸张、发泡件等。
[0017]多孔基底较为常见的，可采用纸，尤其是滤纸。滤纸大多由棉质纤维组成，其表面有无数小孔可供液体粒子通过，而体积较大的固体粒子则不能通过，滤纸具有较好的固体粒子过滤、大分子吸附等功能，且生产成本较低、获取较为便捷。尽管如此，凡是能够实现上述功能的多孔基底，均应落入本发明的保护范围。
[0018]优选的，所述乙酰胆碱酯酶底物包括乙酰胆碱、以及硫代乙酰胆碱或碘化硫代乙酰胆碱等以乙酰胆碱为中心的类似物或取代物，其作用在于:OPs和CBs类农药的浓度与孵育后酶基底中未失活的酶含量呈负相关，未失活的酶将底物水解为胆碱和乙酸，或者胆碱和乙酸的类似物或取代物，进而引起溶液中酸度和成分的变化，通过多种方法检测这种变化进而获得OPs和CBs类农药的浓度信息。检测方法可以包括以下几种:
[0019]I )pH法:多孔基底中添加pH指示剂，较为简单的，可选择pH试纸，当样品中OPs和CBs类农药含量低时，未失活的酶含量就高，孵育后被酶水解产生的乙酸就多，因而孵育后溶液的PH值就偏低，pH试纸的颜色相应发生变化，通过与标准比色卡进行比对，可以推断出孵育后溶液的PH值，进而反推样品中OPs和CBs类农药的含量；
[0020]pH试纸上有甲基红、溴甲酚绿、百里酚蓝这三种指示剂。甲基红、溴甲酚绿、百里酚蓝和酚酞一样，在不同pH值的溶液中均会按一定规律变色。甲基红的变色范围是pH4.4(红)?6.2(黄)，溴甲酚绿的变色范围是pH3.6(黄)?5.4(绿)，百里酚蓝的变色范围是pH6.7(黄)?7.5(蓝)。
[0021]2)电位滴定法:当样品中OPs和CBs类农药含量低时，未失活的酶含量就高，孵育后被酶水解产生的乙酸就多，孵育后溶液的PH值相应发生变化，通过电位滴定，反推样品中OPs和CBs类农药的含量；
[0022]3)测压法:当样品中OPs和CBs类农药含量低时，未失活的酶含量就高，孵育后被酶水解产生的乙酸就多，将溶液与碳酸氢钠相互混合后，由于酸度较高，产生的CO2气体相应增多，气压增大，进而反推获得样品中OPs和CBs类农药的含量；
[0023]4)比色法:当样品中OPs和CBs类农药含量低时，未失活的酶含量就高，孵育后被酶水解产生的胆碱就多，在孵育产物中添加胆碱的显色剂，如二硫双对硝基苯甲酸(DNTB)，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸(DNTB)产生显色反应，使反应液呈黄色(于410nm处有最大吸收峰)，根据吸收峰值反推获得样品中OPs和CBs类农药的含量。
[0024]在以上各检测方法中，优选采用检测过程较为简便的pH法进行检测，具体步骤包括:
[0025]S1、包埋:将丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶包埋至pH试纸中制成检测试纸；
[0026]S2、样品制备:将待检样品与缓冲液混匀，得到样品溶液；
[0027]S3、检测:将样品溶液添加至检测试纸孵育，随后再加入乙酰胆碱酯酶底物孵育一段时间，然后与标准比色卡进行比对，进而检测得到待检样品中的农药残留结果。
[0028]优选的，所述步骤SI中将丝素蛋白制备为丝素蛋白凝胶后，再与乙酰胆碱酯酶包埋至多孔基底中制成酶基底。应当说明的是，凡是能够实现将丝素蛋白制备为凝胶的方法，均应落入本发明的保护范围。丝素蛋白制备凝胶的方法包括化学法和物理法。
[0029]化学方法包括以下两种:
[0030](I)改变溶液酸碱度(pH值)
[0031 ] 丝素蛋白的等电点(pi)在4左右，因而调节丝素蛋白洛液的pH值至4左右可以中和丝素蛋白分子携带的电荷，促进分子间疏水基团的相互作用，进而诱导分子结构的改变及分子间的物理交联，最终形成网络状的凝胶结构。
[0032](2)盐析
[0033]盐析法是指向蛋白质溶液中加入一定量的无机盐(如氯化钠、硫酸铵)，造成蛋白质溶解度的降低，进而从溶液中沉淀析出，是蛋白质化学中常用的纯化方法。由于丝素蛋白结构的特性，如果向丝素蛋白溶液中添加氯化钠和硫酸铵等无机盐，丝素蛋白会快速变性凝聚，形成不稳定的黏稠态的液体，再经过一段时间的孵育形成稳定的半固态凝胶。整个成胶的速度决定于盐浓度，通常需要加入大量的盐颗粒或饱和盐溶液才能在较短的时间内诱导丝素蛋白形成凝胶。
[0034]物理方法包括以下三种:
[0035](I)超声震荡法
[0036]将超声细胞破碎器的探头置于丝素蛋白溶液中，经几秒种的短时间超声波处理，丝素蛋白在溶液中开始变性形成凝胶。成胶的时间可以通过控制超声强度和超声时间来控制。理想状况下固体状的凝胶应在超声结束之后5 —10分钟之后形成，这样可以在成胶之前有充裕的时间向丝蛋白溶液中混入药物分子和细胞。由于该方法简单，本发明优选的制备丝素蛋白凝胶的方法，采用超声振荡法。
[0037](2)旋涡混合法
[0038]旋涡混合法制备丝素蛋白凝胶的原理与超声震荡法相似，都是利用摩擦剪切力诱导丝素蛋白分子变性交联，但由于旋涡混合所产生的摩擦剪切力远远低于超声震荡，因而诱导丝素蛋白形成凝胶的时间也要长很多(通常几个小时以上)，而且可重复性较差。
[0039](3)电泳法
[0040]当将丝素蛋白溶液置于外加电场中时，由于丝蛋白分子表面带有负电荷，在电场中会向正极移动，逐渐聚集在金属电极附近，分子间相互作用，形成黏稠状的胶体团块。这种凝胶的物理性质不稳定，在去掉电场或将电极反转的情况下胶体团块会逐渐消失，回复溶液状态。当将胶体团块从溶液中分离并保存时，黏稠状的胶体会逐渐变硬，最终成为固体状凝胶。
[0041]应当说明的是，不同浓度的丝素蛋白溶液制备成的丝素蛋白凝胶，其微观结构也不相同，因而对于蛋白的保护效果也有差异，优选的，采用3%?5%的丝素蛋白溶液制备丝素蛋白凝胶。
[0042]应当说明的是，所述步骤S2中的缓冲液的作用在于平衡待检样品的pH值，避免待检样品的酸碱度影响后续的检验步骤，缓冲液优选PH值为7-9的各种缓冲液，如硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)与磷酸、硼酸或盐酸的缓冲液。优选的，缓冲液为磷酸缓冲液，优选为PH = 8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
[0043]本发明第二方面提供一种农药残留检测试剂盒，包括包埋有丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶的多孔基底、缓冲液以及乙酰胆碱酯酶底物溶液。
[0044]优选的，所述乙酰胆碱酯酶底物为乙酰胆碱、硫代乙酰胆碱、或碘化硫代乙酰胆碱。
[0045]优选的，还包括标准比色卡，所述多孔基底为pH试纸。
[0046]优选的，所述多孔基底包埋有丝素蛋白凝胶和乙酰胆碱酯酶。
[0047]优选的，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷或N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸与磷酸、硼酸或盐酸的缓冲液。
[0048]本发明第三方面提供一种农药残留检测试纸，为包埋有丝素蛋白凝胶和乙酰胆碱酯酶的PH试纸。
[0049]另外，本发明给出以下定义，以说明和限定本发明所用各术语的含义和范围。
[0050]术语“基底”指的是一种用于承载其它化学组分的、具有一定形状或结构的物质的总称。
[0051]术语“pH指示剂”是指用于酸碱滴定的一类化学试剂中，是一类结构较复杂的有机弱酸或有机弱碱，它们在溶液中能部分电离成指示剂的离子和氢离子(或氢氧根离子)，并且由于结构上的变化，它们的分子和离子具有不同的颜色，因而在pH不同的溶液中呈现不同的颜色。常用的PH指示剂主要有以下四类:I)硝基酚类:这是一类酸性显著的指示剂，如对-硝基酚等;2)酚酞类:包括酚酞、百里酚酞和α-萘酚酞等，它们都是有机弱酸;3)磺代酚酞类:包括酚红、甲酚红、溴酚蓝、百里酚蓝等，它们都是有机弱酸;4)偶氮化合物类:包括甲基橙、中性红等，它们都是两性指示剂，既可作酸式离解，也可作碱式离解。
[0052]借由上述方案，本发明至少具有以下优点:
[0053]I)稳定性好:本发明使用丝素蛋白包埋乙酰胆碱酯酶，不同温度、不同处理方法，保存10个月酶活力几乎没有明显下降；
[0054]2)灵敏度高:使用本方法制作的试纸，可检测低达0.1ppb?1ppm的有机磷和氨基甲酸酯类农药，且高效、精准；
[0055]3)方便直观:本发明对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测结果直观，易于观察，可以直接通过试纸颜色变化对比得到是否有残留农药；
[0056]4)操作简单:本方法无须专业技术人员，操作简单易完成，便于推广与实际应用。
[0057]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0058]图1是本发明第二实施例中对不同浓度农药检测后的颜色对比图；
[0059]图2是本发明第二实施例中对不同浓度农药检测后比色分析结果图；
[0060]图3是本发明第三实施例中对不同浓度农药检测后的颜色对比图；
[0061]图4是本发明第三实施例中对不同浓度农药检测后比色分析结果图。
【具体实施方式】
[0062]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0063]实施例一:
[0064]本实施例提供一种农药残留检测试纸的制作方法，具体包括以下步骤:
[0065]S1、称取蚕丝30克，在摩尔浓度为0.02的Na2CO3水溶液中煮沸30分钟，用去离子水洗净后置于通风橱风干后，置于摩尔浓度9.3的溴化锂中，60度、4小时溶解成为丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液装入透析袋中，在去离子水中透析36小时，期间换6次水；离心除去杂质，得到的丝素蛋白水溶液并稀释为浓度4% ;
[0066]S2、取2ml丝素溶液，放置于超声波细胞粉碎机中，超声功率为20?40%，超声时间为I?10分钟，超声功率优选30%，时间优选为3?4分钟；向其中添加乙酰胆碱酯酶，且乙酰胆碱酯酶相对丝素溶液的用量为0.02?0.25u/g，优选0.13u/ml，轻轻搅匀得到混合溶液；
[0067]S3、取混合溶液200yL，滴加到摆有pH = 5.0?9.0的精密pH试纸的24孔板中，待成胶后置于通风橱，室温通风干燥12小时后得到试纸-酶-丝素蛋白膜。
[0068]实施例二
[0069]本实施例采用实施例一中提供的试纸-酶-丝素蛋白膜，并提供一种农药残留的检测方法，具体包括以下步骤:
[0070]31、分别取5(^不同浓度农药、将90(^浓度为0.111101/1^!1 = 8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液PH=S的缓冲液，加入到载有试纸-酶-丝素蛋白膜的24孔板中，分别取50
度为O、0.002、0.02、0.2、1、2、4、10、20、1000、200mg/L的对氧磷农药加入到不同的孔中，37 °C孵育15分钟
[0071 ] S2、膜完全浸湿之后，每孔加入50μΙ^?度为0.2mol/L的乙酰胆碱溶液，37°C条件下反应，30分钟后检测试纸颜色对比如图1所示，图中加入农药浓度从左到右分别为0、0.002、0.02、0.2、l、2、4、10、20、1000、200mg/L，根据图1中的显色结果进一步量化分析，结果如图2所示，根据该图可制作标准曲线，实际检测过程中可相应比对该图确定样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的浓度。
[0072]实施例三
[0073]本实施例采用实施例一中提供的试纸-酶-丝素蛋白膜，并提供一种对果蔬中农药残留的检测方法，包括以下步骤:
[0074]S1、将沾有农药的待测蔬菜研磨，取一定量分别加入到离心管中，再在离心管中加入一定量浓度为0.01?0.lmol/L的pH=7.0?9.0的磷酸缓冲液，超声震荡10分钟；
[0075]S2、取出混合液，分别加入到做好的试纸-酶-丝素蛋白膜中，37°C孵育15分钟；
[0076]S3、待膜完全浸湿之后，加入乙酰胆碱溶液，37 °C条件下反应，10?30分钟后与标准比色卡进行颜色对比。
[0077]本发明以白菜沾染不同特定浓度的农药以进行检测为例，做详细说明，具体步骤如下:
[0078]S1、样品制备:把4份分别沾有50yL浓度为O、0.1、0.2、0.4mg/L对氧磷的白菜进行研磨，分别取2g加入到离心管中，再在离心管中加入4mL浓度为0.1mol/L、pH=8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，超声震荡1分钟。
[0079]S2、分别取出混合液950yL加入到载有试纸-酶-丝素蛋白膜的24孔板中，37°C孵育15分钟。
[0080]S3、膜完全浸湿之后，每孔加入50μΙ^?度为0.2mol/L的乙酰胆碱溶液，37°C条件下反应，30分钟后检测试纸颜色对比如图3所示，图中加入农药浓度从左到右分别为0、0.1、
0.2、0.4mg/L，根据图3中的显色结果进一步量化分析，结果如图4所示，可参照标准曲线，推算出白菜中的农药残留量。
[0081]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种农药残留检测方法，其特征在于:包括以下步骤: 51、包埋:将丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶包埋至多孔基底中制成酶基底； 52、样品制备:将待检样品与缓冲液混匀，得到样品溶液； 53、检测:将样品溶液添加至酶基底孵育，随后再加入乙酰胆碱酯酶底物孵育一段时间，然后采用PH法、电位滴定法、测压法或比色法检测得到待检样品中的农药残留结果； 其中，若采用PH法检测，则多孔基底中还含有pH指示剂;若采用电位滴定法，则还包括将孵育产物进行电位滴定的步骤;若采用测压法，则还包括测量孵育产物与碳酸氢钠作用所放出CO2气体的压力的步骤;若采用比色法，则还包括向孵育产物中添加乙酰胆碱酯酶底物水解产物的显色剂的步骤。2.根据权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于:所述乙酰胆碱酯酶底物为乙酰胆碱、硫代乙酰胆碱、或碘化硫代乙酰胆碱。3.根据权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于:包括以下步骤: 51、包埋:将丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶包埋至pH试纸中制成检测试纸； 52、样品制备:将待检样品与缓冲液混匀，得到样品溶液； 53、检测:将样品溶液添加至检测试纸孵育，随后再加入乙酰胆碱酯酶底物孵育一段时间，然后与标准比色卡进行比对，进而检测得到待检样品中的农药残留结果。4.根据权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于:所述步骤SI中将丝素蛋白制备为丝素蛋白凝胶后，再与乙酰胆碱酯酶包埋至多孔基底中制成酶基底。5.根据权利要求4所述的农药残留检测方法，其特征在于:所述步骤SI中采用3%?5%的丝素蛋白溶液制备丝素蛋白凝胶。6.根据权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于:所述步骤S2中的缓冲液为硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷或N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸与磷酸、硼酸或盐酸的缓冲液。7.—种农药残留检测试剂盒，其特征在于:包括包埋有丝素蛋白和乙酰胆碱酯酶的多孔基底、缓冲液以及乙酰胆碱酯酶底物溶液。8.根据权利要求7所述的农药残留检测试剂盒，其特征在于:还包括标准比色卡，所述多孔基底为pH试纸。9.根据权利要求7所述的农药残留检测试剂盒，其特征在于:所述多孔基底包埋有丝素蛋白凝胶和乙酰胆碱酯酶。10.一种农药残留检测试纸，其特征在于:为包埋有丝素蛋白凝胶和乙酰胆碱酯酶的pH试纸。
【文档编号】G01N21/80GK105928940SQ201610538541
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】郑兆柱, 王晓沁, 鲁镝思
【申请人】苏州大学