用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片和药物残留检测技术领域，尤其涉及一种用于检测食品中头 孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 头孢类抗生素属于e-内酰胺类药物，具有抗菌谱广、抗菌作用强、耐青霉素酶等 优点。在畜牧养殖中常用于治疗败血症、脑膜炎心内膜炎等。不合理的使用造成这些药物 在动物源性组织中蓄积。人食用这些动物源性食品后，出现过敏反应，甚至休克，对人类健 康构成了严重威胁。大量药物的滥用，还会导致耐药菌株的产生，破坏生态环境。为了保证 人类食品安全和生态环境的稳定，我国对这些药物规定了最高残留限量。如何检测这些药 物在动物源性食品中的残留成了亟待解决的问题，特别是研发一种快速、灵敏、操作简单的 兽药残留检测技术及产品是非常必要的。目前兽药残留检测方法存在不足，如仪器方法操 作复杂，仪器化程度高且价格昂贵，微生物法灵敏度和特异性低，Elisa检测组分单一，胶体 金技术只能定性检测。
[0003] 蛋白质芯片技术是后基因组时代的产物，是研宄基因功能和蛋白质的有力工具， 近年来发展地相当迅速。蛋白质芯片是将大量蛋白质探针（抗原、抗体、受体等）或肽链有 序排列固定在载体上，利用蛋白质探针或肽链特异性地与配体分子结合的原理，芯片上的 蛋白质探针或肽链与样品中的相应成分反应，然后加入标记物质，最后用芯片扫描仪扫描 并存储结果。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片 试剂盒。
[0005] 该试剂盒包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，所述抗体由头孢氨苄单 克隆抗体和头孢噻呋单克隆抗体组成，所述头孢氨苄单克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201340杂交瘤细胞3A6所分泌的，能识别头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定；所述头孢 噻呋单克隆抗体是由保藏号为CCTCCN0:C201341杂交瘤细胞4D5所分泌的，能识别头孢 噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟，所述芯片固定了头孢氨苄包 被原和头孢噻呋包被原，所述头孢氨苄包被原是由头孢氨苄采用戊二醛法与卵清白蛋白偶 联，所述头孢噻呋包被原是由头孢噻呋采用碳二亚胺法与卵清白蛋白偶联。
[0006] 所述杂交瘤细胞3A6,申请人已于2013年03月28日送位于湖北省武汉市武汉大 学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCN0:C201340。
[0007] 所述杂交瘤细胞4D5,申请人已于2013年03月28日送位于湖北省武汉市武汉大 学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCN0:C201341。
[0008] 所述芯片按如下方法制备：以晶芯高分子基片G作为基片，用围栏将基片分成两 排共12个反应区域，每个反应区域设四排三纵共12个微阵列（4X3阵列），将头孢氨苄包 被原溶液、头孢噻呋包被原溶液以及两种对照溶液一一卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清 白蛋白溶液分别点样在其中一排微阵列上，点样完成后固定〇.5h，用2% (重量百分比）牛 血清白蛋白溶液封闭〇. 5h。
[0009] 所述头孢氨苄包被原溶液的浓度为6yg/mL，所述头孢噻呋包被原溶液的浓度为 32yg/mL，所述头孢氨苄包被原溶液和头孢噻呋包被原溶液的溶剂是含有5% (重量百分 比）甘油的pH值为9. 16的碳酸盐缓冲液。
[0010] 所述微阵列上的点样顺序是从上到下，从左至右。
[0011] 所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
[0012] 所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取甲醇10mL，超纯水稀释，定容至 100mL〇
[0013] 本发明的第二个目的是提供所述的抗体芯片试剂盒在检测食品中头孢类抗生素 残留的应用。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片 方法，该方法包括以下步骤：
[0015] 1)样品前处理：样品匀浆后加入提取试剂提取；
[0016] 2)将样品液和稀释好的抗体混合后加入到固定了头孢氨苄包被原溶液、头孢噻呋 包被原溶液、以及对照溶液一一卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液的芯片上，于 37°C反应0. 5h，洗涤3次，甩干。
[0017] 3)将Cy3标记的二抗加到芯片，于37°C反应0. 5h，洗涤3次，甩干；
[0018] 4)用InnoScan700A扫描仪对芯片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵 清白蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析。
[0019] 所述抗体由头孢氨苄单克隆抗体和头孢噻呋单克隆抗体组成，所述头孢氨苄单克 隆抗体是由保藏号为CCTCCN0:C201340杂交瘤细胞3A6所分泌的，能识别头孢氨苄、头孢 羟氨苄和头孢拉定；所述头孢噻呋单克隆抗体是由保藏号为CCTCCN0:C201341杂交瘤细 胞4D5所分泌的，能识别头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟；
[0020] 所述头孢氨苄包被原是头孢氨苄与卵清白蛋白的偶联物，所述头孢噻呋包被原是 头孢噻呋与卵清白蛋白的偶联物；
[0021] 所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
[0022] 所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取甲醇10mL，超纯水稀释，定容至 100mL〇
[0023] 所述抗体是用pH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释的，其中头孢氨苄单克隆抗体的稀释度 为1:10000,头孢噻呋单克隆抗体的稀释度为1:12000 ;所述头孢氨苄包被原溶液的浓度为 6yg/mL，所述头孢噻呋包被原溶液的浓度为32yg/mL，所述头孢氨苄包被原溶液和头孢噻 呋包被原溶液的溶剂是含有5%甘油的pH9. 16的碳酸盐缓冲液。
[0024] 本发明的有益效果是：
[0025] 1)本发明的抗体芯片试剂盒可以同时检测8种头孢类药物一一头孢氨苄、头孢羟 氨苄、头孢拉定、头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟，为食品 中的头孢抗生素残留检测提供了一个快速、灵敏、高通量的方法。而现有的试剂盒无法同时 检测以上药物。
[0026] 2)本发明所建立的抗体芯片试剂盒和检测方法准确度高，精密度好、检测效率高。 与现有的方法相比，不仅在检测药物的种类上具有明显的优势，而且可以节省大量的时间 和成本，具有更好的市场应用价值。方法中所涉及的样品前处理方法简单，快速，所使用的 有机溶剂为甲醇，对人体及环境危害较小。再者，本发明采用示踪物质是荧光物质，信号持 续时间长。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明的技术路线图。
[0028] 图2是基片优化的结果，图中1是不同基片相对荧光信号强度的比较；2是不同基 片背景值的比较。
[0029] 图3是4种点样顺序以及点样顺序的优化结果，图中1是点样效果示意，2、3、4、5 是4种点样顺序，3是最优的点样顺序图。
[0030] 图4是点样溶液和封闭液的优化结果，图中1是不同缓冲溶液作为点样液的优化 结果；2是不同pH的CBS作为点样液的优化结果；3是添加不同表面活性的固定效果的比 较；4是封闭液的优化结果。
[0031] 图5是抗体稀释液和反应温度的优化结果，图中1是一抗稀释液的优化结果；2是 二抗稀释液的优化结果；3是反应温的优化结果。
[0032] 图6是制备抗体芯片过程中各时间的优化结果，图中1是固定时间的优化结果；2 是封闭时间的优化结果；3是一抗反应时间的优化结果；4是二抗反应时间的优化结果。
[0033] 图7是本发明采用的固相载体以及分区示意图，图中1 :玻片；2 :晶芯高分子基片 G修饰物；3 :12个分区围栏。
[0034] 图8是绘制的标准曲线，图中CLX:头孢氨苄；CRO:头孢噻呋。
[0035] 图9是抗体芯片37°C加速稳定性实验结果，图中CLX:头孢氨苄；CRO:头孢噻呋。
【具体实施方式】
[0036] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0037] 实施例1抗头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定的单克隆抗体的制备
[0038] 1. 1免疫原的制备
[0039] 准确称取头孢氨苄36. 5mg，完全溶解在4mL的PBS中为A液。准确称取BSA68mg， 使其充分溶解在6mLPBS中为B液。另取碳二亚胺（EDC) 120.Omg和N-