一种肝窦内皮细胞分离培养试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种肝窦内皮细胞分离培养试剂盒，包括盒体和设在盒体内的四个无菌密封瓶，所述四个无菌密封瓶内分别装有用于肝窦内皮细胞分离培养的清洗浓缩液、消化液、分离液、培养液。该试剂盒包含分离培养肝窦内皮细胞中所需的所有试剂，无需额外配制试剂，实验方便快捷；所有的试剂瓶均采用无菌密封瓶，无需灭菌，操作简单。
【专利说明】
_种肝窦内皮细胞分禹培养试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型属于细胞培养技术领域，涉及一种肝窦内皮细胞分离培养试剂盒。
【背景技术】
[0002]肝窦内皮细胞(Sinusoidal Endothelial cells, SECs)是肝脏内数量最多的非实质细胞，其在肝脏微循环、肝再生、肝移植缺血再灌注损伤及移植免疫耐受的诱导过程中的作用已引起科研人员重视，原代分离、培养高纯度和高活力的肝窦内皮细胞是研究其在肝脏各种病理生理环境中作用机制的基础。
[0003]目前，肝窦内皮细胞分离培养往往需要配置多种试剂完成清洗、消化、分离和培养等不同的步骤，不仅操作复杂而且还需要灭菌，整个分离培养过程效率较低。
【实用新型内容】
[0004]本实用新型的目的在于针对现有技术的不足，提供一种包含实验中所需的所有试剂无需额外配制试剂、无需灭菌、方便快捷的肝窦内皮细胞分离培养试剂盒。
[0005]本实用新型所采用的技术方案是:
[0006]—种肝窦内皮细胞分离培养试剂盒，包括盒体和设在盒体内的四个无菌密封瓶，所述四个无菌密封瓶内分别装有用于肝窦内皮细胞分离培养的清洗浓缩液、消化液、分离液、培养液。
[0007]进一步的，所述装有清洗浓缩液、消化液和分离液的无菌密封瓶的容量为50mL，所述装有培养液的无菌密封瓶的容量为100mL。
[0008]本实用新型的有益效果是:
[0009]该试剂盒包含肝窦内皮细胞分离培养实验中所需的所有试剂，无需额外配制试剂，实验方便快捷;所有的试剂瓶均采用无菌密封瓶，无需灭菌，操作简单。
【附图说明】
[0010]图1是本实用新型的示意图。
[0011 ]图中:1-盒体;2-装有清洗浓缩液的无菌密封瓶;3-装有消化液的无菌密封瓶;4-装有分离液的无菌密封瓶;5-装有培养液的无菌密封瓶;6-使用说明书。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和实施例对本实用新型作进一步说明。
[0013]如图1所示，一种肝窦内皮细胞分离培养试剂盒，包括盒体、设在盒体内的四个无菌密封瓶和使用说明书6，所述四个无菌密封瓶内分别装有用于肝窦内皮细胞分离培养的清洗浓缩液、消化液、分离液、培养液;所述装有清洗浓缩液、消化液和分离液的无菌密封瓶的容量为50mL，所述装有培养液的无菌密封瓶的容量为100mL。该试剂盒包含肝窦内皮细胞分离培养实验中所需的所有试剂，无需额外配制试剂，实验方便快捷;所有的试剂瓶均采用无菌密封瓶，无需灭菌，操作简单。
[0014]下面以SD大鼠肝窦内皮细胞分离培养实验为例，说明该试剂盒在实验中的应用。
[0015]在本实施例中，所述清洗浓缩液为10XPBS溶液，使用本试剂盒时用无菌蒸馏水稀释成I XPBS的工作液，用于灌注时冲洗血管内的血细胞和PercolI溶液的配制。
[0016]在本实施例中，所述消化液为用PB S配制的胶原酶IV溶液，含0.2 %胶原酶IV、
0.001% DNase 1、5%胎牛血清，可将肝脏组织消化解离为单个细胞，本试剂盒采取离体反复多次消化的方式，能将肝脏组织充分消化成单细胞并节省酶的用量。
[0017]在本实施例中，所述分离液为100%Percoll分离液，使用时用I XPBS按体积比1:1和1: 3配制成50% Percol I和25% Percol I溶液，用于细胞密度梯度离心，吸取在50%和25%Percol I界面层间的细胞。
[0018]在本实施例中，所述培养液为在DMEM高糖的基础上添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素、lOOyg/mL链霉素和多种细胞生长因子，提供肝窦内皮细胞生长所需营养。
[0019]在具体操作前，为保存酶和营养物质的活性应该将试剂盒置于2?8°C低温保存。
[0020]实验具体操作步骤如下:
[0021]1、将试剂盒内溶液取出置于超净工作台内，待溶液恢复至室温。
[0022]2、用无菌蒸馏水按体积比9:1稀释清洗浓缩液，即450mL蒸馏水:50mL清洗浓缩液，混勾后备用。
[0023]3、将SD大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，无菌状态切开腹部，用输液栗将清洗液以10mL/min的速度从门静脉灌入，同时剪开肝下腔静脉，让清洗液流出，灌注将血管内血液清洗干净，减少后期消化所得的细胞含有血细胞，待肝脏由鲜红色变成均匀的土黄色时终止灌注。
[0024]4、完整剪下肝脏置于平皿中，清洗液润洗肝脏表面。用1mL消化液反复灌注2-3次，待肝实质呈菜花状、肝包膜已与实质分离时用眼科镊提起肝脏，去除包膜、血管及结缔组织。
[0025]5、在平皿中将剩下的组织剪碎，剪成尽量小的组织块，5mL消化液重悬后转移到15mL离心管内，37°C振荡消化1min，加入培养液终止消化。
[0026]6、细胞悬液10g离心5min，将上清转移到无菌容器内。沉淀的组织块用清洗液洗一次后继续用5mL消化液37°C振荡消化，离心后收集上清，沉淀继续消化，重复消化2-3次，将收集到的细胞悬液用150目不锈钢筛网过滤，收集滤过液。
[0027]7、滤过的肝脏细胞悬液用清洗液离心洗涤2次，400g离心1min，细胞沉淀用1mL
清洗液重悬。
[0028]8、清洗液按比例稀释分离液，即清洗液:分离液按体积比1:1和3:1分别配制成50%Percoll和25% Percoll溶液。
[0029]9、在50mL尖底离心管中，沿管壁依次加入50% Percoll溶液15mL，25% Percoll溶液20mL和1mL细胞悬液，900g离心20min，小心吸取50%和25% Percoll界面层的富含肝窦内皮细胞的混浊带。
[0030]10、加等体积清洗液，混匀，900g离心lOmin，沉淀悬于1mL培养液中。用血细胞计数板进行细胞计数，将细胞浓度调整为1.2?1.5 X 16个/mL，细胞悬液接种24孔板，每孔lmL。培养板放37°C温箱静置孵育20min，待KupfTer细胞选择性贴壁后，收集未贴壁细胞悬液，即为肝窦内皮细胞，37 °C温箱继续培养，观察细胞状态，每两天换新鲜培养液一次。
[0031]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本实用新型所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种肝窦内皮细胞分离培养试剂盒，其特征在于:包括盒体和设在盒体内的四个无菌密封瓶，所述四个无菌密封瓶内分别装有用于肝窦内皮细胞分离培养的清洗浓缩液、消化液、分尚液、培养液。2.如权利要求1所述的一种肝窦内皮细胞分离培养试剂盒，其特征在于:所述装有清洗浓缩液、消化液和分离液的无菌密封瓶的容量为50mL，所述装有培养液的无菌密封瓶的容量为I OOmL。
【文档编号】C12N5/071GK205420442SQ201520725886
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年9月19日
【发明人】冷毅斌, 胡勤芹, 吴娟
【申请人】武汉普诺赛生命科技有限公司