专利名称：乙肝速测试剂制备及药盒试验系统的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学检验技术领域，主要适用于乙型肝炎五项指标的快速检验、测试。
我国属于肝炎高发区，全国肝炎病人两千七百万之多，每年新发病例九百多万，乙型肝炎病毒携带者也高达一亿人左右，是危害较大的重要传染病之一。在本发明以前的现有技术中，对乙肝五项指标(HBsAg-表面抗原、抗-HBs-表面抗体、HBeAg-E抗原、抗-HBe-E抗体、抗-HBc-核心抗体)的检验诊断方法及其相应的试剂，已有不少，如对流免疫电泳法(CIEP)、间接血凝抑制法(HAI)、免疫粘附血凝法(IAHA)、反向间接血凝法(RPHA)等，其中近年来被普遍采用的敏感度高、特异性好的试验主要有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)以及免疫电镜法(IEM)，但是，由于乙肝病毒具有三类抗原及相应的抗体系统，需检测的标志很多，而目前上述多种检测方法，大多不成系列，引起检验上的不便，有的虽然敏感度高，特异性好，但不够简便、快速，或者检验成本太高，有的虽然简便快速，但敏感度和特异性又欠佳。因此，建立一套兼备敏、准、快、简的系列乙肝检测诊断方法及配套试剂，是免疫、传染病临床检验等医学界竞相研究的课题。第四军医大学第二附属医院从研制新型免疫载体入手，成功地研制出新的乙肝五项指标的敏、准、快、简系列检测诊断方法及相应试剂。试验方法包括乳凝集试验、反向乳凝集试验、乳凝集抑制试验。上述各项试验与酶联免疫吸附法进行对比试验的结果表明，五项指标(即通常所说的两对半)的符合率均在86.3%～96.0%之间，其特异性和敏感性良好。阻断试验表明上述试验确属于特异性反应。乳凝集试验及反向乳凝集试验的反应时间仅需要3分钟，乳凝抑制试验的反应时间仅需30分钟，所有试验不需任何设备，操作简便，反应快速，易于推广。
本发明的目的之一在于为上述试剂提供简易可行的工艺制备方法，现将其技术解决方案叙述如下本发明试剂的制备方法可适用于上述五种试剂，即HBsAg反向乳凝试剂、抗-HBs乳凝试剂、HBeAg反向乳凝试剂、抗-HBe乳凝抑制试剂、抗-HBc乳凝抑制试剂，五种试剂制备方法基本相同，只是在测效价时所用的抗原分别为上述五种致敏抗体的相应抗原。
本发明试剂所用材料为1、聚苯乙烯乳胶，2、牛血清白蛋白、3、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc、单克隆抗体。制备方法取不同稀释度的单克隆抗体与等容量的5%聚苯乙烯乳胶混匀，每组置37℃水浴中30分钟，每10分钟摇一次，以3000转/分转速进行分离，弃去上清液，剩下沉淀用含0.4%牛血清白蛋白生理盐水液悬浮至1%乳浓。用各致敏抗体的相应抗原测效价。各抗体与聚苯乙烯胶乳的最适比例为1∶20。
本发明的另一目的是提供一个试剂药盒形式的乳凝集系列检测系统。试剂药盒内装有五个小瓶，每个小瓶分别装有1～1.5毫升的HBsAg反向乳凝试剂、抗-HBs乳凝试剂、抗-HBc乳凝抑制试剂、HBeAg反向乳凝试剂、抗-HBe乳凝抑制试剂。每瓶试剂中含有作为免疫载体的聚苯乙烯乳胶，作为致敏原的各抗体相应的抗原以及作为包被的0.4%的牛血清白蛋白。在检测HBsAg和HBeAg时，取待检标本25微升滴加于清洁的乳凝板上，然后分别加入HBsAg、HBeAg反向乳凝试剂25微升，用细玻璃棒混匀，摇动1～3分钟观察结果。如试验圈呈“艹”以上的凝集，而阴性对照圈不凝者，为阳性反应。阳性标本，进行倍比稀释，测定效价。在检测抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc时，以纯化的HBsAg、HBeAg、HBcAg为抑制抗原，抑制标本的抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc与反向乳凝试剂发生凝集反应。取待检标本25微升，加于乳凝板的反应圈内，再加抑制抗原25微升，置37℃温箱孵育5分钟，然后各圈内加反向乳凝试剂25微升，混匀、摇动反应板，5分钟后观察结果。如对照圈内出现凝集，试验圈不凝集或显著减弱者为阳性。
凝集反应强度的判断标准为
“
”全部呈颗粒状凝集，周围边有凝集圈，液体清亮。
“
”大部分凝集，周围边有凝集圈，液体微浊。
“艹”约半量凝集，颗粒较细，液体混浊。
“+”少许凝集。
“-”均匀乳状，与对照圈同。
本发明同国内外ELISA、RPHA、CIEP等检测方法、制备工艺等技术相比，检测敏感度、特异性好，制备方法简单，操作简便，反应快速，成本低廉，为乙型肝炎抗原抗体的检测诊断开辟了新途径，尤其对部队及广大基层临床上推广应用，对普查乙肝病毒感染、粗筛献血人员及卫生防疫、流行病调查等方面均有实用意义。
权利要求
1.一种乙型肝炎检测试剂的制备方法，采用聚苯乙烯乳胶作为载体，其特征在于取不同稀释度的单克隆抗体与等量的5%的聚苯乙烯乳胶混匀，每组置37℃水浴中30分钟，每10分钟摇一次，以3000转/分转速进行分离，弃去上清液，剩下沉淀用含0.4%牛血清白蛋白生理盐水悬浮至1%乳浓，用各致敏抗体的相应抗原测效价。
2.根据权利要求1中所述的一种乙型肝炎检测试剂的制备方法，其特征在于各抗体与聚苯乙烯乳胶的最适合的比例为1∶20。
3.一种根据权利要求1的制备方法所提供的试剂配套使用的药盒形式的乳凝系列检测系统，其特征在于药盒内有五个小瓶，分别装有HBsAg反向乳凝试剂、抗-HBs乳凝试剂、抗-HBc乳凝抑制试剂、HBeAg反向乳凝试剂、抗-HBe乳凝抑制试剂，每瓶试剂中都含有作为免疫载体的聚苯乙烯乳胶，作为致敏原的各抗体相应的抗原以及作为包被的0.4%的牛血清白蛋白。
4.根据权利要求3中所述的与制备方法所提供的试剂配套使用的药盒形式的乳凝集系列检测系统，其特征在于检测HBsAg和HBeAg时，取待测标本25微升滴加于清洁的乳凝板上，然后分别加入HBsAg、HBeAg反向乳凝试剂25微升，混匀、摇动1～3分钟观察结果。如试验圈呈“艹”以上的凝集，而阴性对照圈不凝者，为阳性反应，阳性标本，进行倍比稀释，测定效价。
5.根据权利要求3所述的与制备方法所提供的试剂配套使用的药盒形式的乳凝集系列检测系统，其特征在于检测抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc时，以纯化的HBsAg、HBeAg、HBcAg为抑制抗原，抑制标本的抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc与反向乳凝试剂发生凝集反应，取待检标本25微升，加于乳凝板的反应圈内，再加抑制抗原25微升，置37℃温箱孵育5分钟，各圈内加反向乳凝抑制试剂25微升，混匀、摇动，5分钟后观察结果。如对照圈内出现凝集，试验圈不凝集或显著减弱者为阳性。
全文摘要
本发明属于免疫学检验技术领域，主要适用于乙肝五项指标的快速检验、测试中。本发明包括五种试剂的制备方法及配套使用的药盒。用聚苯乙烯作为免疫载体，用各抗体的相应抗原作为致敏原，用牛血清白蛋白作为包被，经混合、水浴、离心分离、悬浮等工艺过程制备而成。配之以方便简易的药盒，不仅可使乙型肝炎五项指标的检验敏感度高，特异性好，而且快速、简便、造价低廉，极易推广使用。
文档编号G01N33/576GK1065340SQ91101980
公开日1992年10月14日 申请日期1991年3月27日 优先权日1991年3月27日
发明者杨崇华 申请人:中国人民解放军第四军医大学第二附属医院