一种郁金香碎色病毒rt-lamp检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物检测领域，具体地说，本发明设及一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 郁金香是国际名花之一，W高贵、典雅为世界人民所宠爱，是欧亚等地区近20个 国家的国花。近年来，我国各地相继举办了郁金香花展，获得了较好的效益。虽然郁金香在 我国很早就有少量栽培，但大部分仍从荷兰等国家进口。20世纪80年代中后期W来，我国 从国外引进郁金香商品种球数量逐年成倍增长，其携带的一些有害生物也随之传入，包括 真菌、细菌、线虫和病毒等，潜在危害性很大。郁金香碎色病是种球常见感染之一，其造成种 球退化，严重影响了郁金香的生产。
[0003]引起郁金香碎色病的病原体是郁金香碎色病毒（Tulipabreakingvirus,TuBV)， 病毒粒子大小为7〇〇nmX(12-13)nm。感染化BV的主要症状是叶片出现浅绿色或灰白色 条斑，有时形成花叶，在红花和紫花品种上产生碎色花，花瓣上形成大小不等浅色斑点或条 斑，严重时植株生长不良，还可危害百合类花弁。
[0004] 目前检测郁金香病毒多使用抗血清的化ISA法或RT-PCR法，然而该两种方法均存 在不足；ELISA法须制作抗血清，非特异反应多，易产生假阳性或假阴性结果，而RT-PCR灵 敏度和特异性不高。因此，有必要开发一种快速、准确的化BV检测方法，W满足产业需求。
[0005] 环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP) 是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法（见文献NotomiT,化ayamaH,Masubuchi H,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplification ofDM.NucleicAcidsRes. 2000化n15 ;28 (12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需模板 的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增， 且无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。
[0006] 逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAM巧是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏 度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录 酶，使RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
[0008] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、BstDM聚合酶和核酸染料，其中所述 引物的核巧酸序列如下所示：
[0009] 外引物F3 ;TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQIDN0:1)
[0010] 外引物B3 ;CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQIDN0:2)
[0011] 内引物FIP;CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
[0012] GTTAAATCTGGAGTGT(沈QIDN0:3)
[0013]内引物BIP;ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC
[0014]AACTGCTCG(SEQIDN0:4)〇
[0015] 优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/y1，所述内引物FIP 和所述内引物BIP的浓度均为40pmol/y1。
[0016] 优选地，所述反应缓冲液由lOmMdNTP、10X化ermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mMM拆〇4组成。
[0017] 优选地，所述BstDNA聚合酶的浓度为8U/y1。
[0018] 优选地，所述核酸染料为SYBRGreenI。
[0019] 优选地，本发明的试剂盒进一步包括RNA提取试剂W及阳性对照和阴性对照。
[0020] 在另一个方面中，本发明还提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，其包括 W下步骤：
[0021] (1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA;
[002引 （2)设计并合成引物，其中所述引物的核巧酸序列如下所示：
[0023]外引物F3 ;TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQIDN0:1)
[0024]外引物B3 ;CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQIDN0:2)
[00巧] 内引物FIP;CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
[0026]GTTAAATCTGGAGTGT(沈QIDNO:3)
[0027] 内引物BIP;ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC
[0028]AACTGCTCG(SEQIDNO:4)；
[002引 做在PCR管中制备25yl的RT-LAMP反应体系，其包括5pmol/yl的外引物 F31yl、5pmol/yl的外引物B31yl、40pmol/yl的内引物FIPlyl、40pmol/yl的内弓| 物BIPlyl、反应缓冲液2. 5yl、2UAMV逆转录酶lyl、8UBstDNA聚合酶lyl、模板 DM2yl，加水补充至25yl，并W郁金香碎色病毒基因组DM作为阳性对照，WlOOmM Tris-肥1P服.0和50mM邸TA作为阴性对照；
[0030] (4)LAMP反应；将步骤（3)中PCR管于63°C恒温反应60min;
[003。妨分析判断反应产物结果；在（4)中所得反应产物中加入1y1核酸染料，如反 应液颜色为澄色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[003引优选地，所述反应缓冲液由lOmMdNTP、10XThermo化1反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mMM拆04组成。
[0033] 优选地，所述核酸染料为SYBRGreenI。
[0034] 本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒和检测方法针对病毒保守区域设 计特异性和灵敏度高的四条引物，且一步完成逆转灵和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效， 且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，鉴定简便，较传统的 检测方法优势显著。
【具体实施方式】
[0035]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0036] 实施例1本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒的制备
[0037] 1. 1试剂
[00測引物由天根生化科技（北京）有限公司合成；BstDM聚合酶和10X化ermoPol反 应缓冲液购自肥B;AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBRGreenI购自Invitrogen;其余 PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。