一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽病检测领域，特别涉及猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白的单克隆抗体 及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（Circoviridae，Circovirus，Porcine circovirus，PCV)是迄今发 现的一种最小的动物病毒，已知的PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2,其中PCV1没有致病 性，PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS)的主要病原，它不仅可以引起断奶仔猪发 生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天震颤（A2CT)、猪繁殖障碍、猪皮炎肾炎综合征（PDNS)、增 生性坏死性肺炎（PNP)和呼吸道疾病综合征（PRDS)有关，这些疾病统称为猪圆环病毒病 (PCVD)。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业的发展，给许多国家和地区带来了巨大的 损失。更为严重的是PCV2的感染可以降低抵抗力和免疫应答反应，引起其它各种病原微生 物的继发感染，造成的间接损失难以估计。目前，PCV2已成为严重阻碍我国养猪业发展的 重要病原之一。
[0003] PCV2及其相关的猪的疾病已在世界范围内发生和流行，死亡率10%~30%不等， 较严重的地区，猪场在爆发本病时死亡淘汰率高达40%，严重影响了我国养猪业的健康发 展。而且，临床上PCV2的感染普遍存在，但多数表现为隐性感染和亚临床感染，常易被忽 视，在猪群受到应激反应后，可能导致PCV2的爆发，因此，做好PCV2病原学的诊断和监测， 对控制PCV2的感染具有重要意义。
[0004] 为了更为准确的诊断PCV2,亟需开发出一种新的检测方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了抗猪圆环病毒2型（PCV2)的核衣壳蛋白 (Cap)的单克隆抗体及检测猪圆环病毒2型的试剂盒，所述试剂盒选自ELISA检测试剂盒或 酶免疫层析检测试剂盒。
[0006] 本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型试剂盒，所述试剂盒包括由杂交 瘤细胞系CCTCC N0:C2014199分泌产生的单克隆抗体，和/或由杂交瘤细胞系CCTCC N0: C2014198分泌产生的单克隆抗体。也就是说，所述试剂盒中可单独的包括上述两种单克 隆抗体，也可以同时包括上述两种单克隆抗体。在本发明中，经过发明人对筛选出的特异 性强、亲和力常数高的单克隆抗体的配对研究发现，当同时包括上述两种单克隆抗体时，对 PCV2的检测效果更佳。但是，当抗体组合配对使用时，并不是简单地将两个亲和力常数高的 单克隆抗体配对后便能达到优良的检测效果，因为其中受限的因素很多，包括已知的或未 知的因素，例如两个单克隆抗体配对使用时，要考虑两个单克隆抗体之间、两个单克隆抗体 分别与抗原之间的相互关系，甚至包括所使用的单克隆抗体是否与非PCV2存在非特异性 的反应和显色本底均会影响单克隆抗体的配合使用。本申请的所述两个单克隆抗体的配 合使用，在优化后的条件下，ELISA试剂盒的灵敏度能够达到1.0ng/mL，酶免疫层析检测试 剂盒的灵敏度能够达到2. Ong/mL。也就是说，两种试剂盒的灵敏度均显著地高于检测所述 PCV2的同类别试剂盒的灵敏度。并且两种试剂盒的特异性达到了 100%。这充分说明了包 括所述两个单克隆抗体的试剂盒的性能显著优于现有技术中的试剂盒。
[0007] 在本发明中，由杂交瘤细胞系CCTCC NO :C2014199分泌产生的单克隆抗体命名为 2F8,由杂交瘤细胞系CCTCC NO :C2014198分泌产生的单克隆抗体命名为3G12。
[0008] 术语"猪圆环病毒2型Cap全蛋白"是指猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白全蛋白 (Capsid protein，Cap)，是一种单体磷酸化的多肽，分子量大小约为27. 8kDa，是PCV2的主 要免疫原性蛋白（Nawagitgul.P, Morozov. I，Bolin. S R，et al. Open reading frame 2of porcine circovirus type 2encodes a major capsid protein. J Gen Virol. , 2000, 81(Pt 9):2281-2287);该全蛋白具有特异性，且可以自我装配成病毒衣壳颗粒（陈燕凌等，猪圆 环病毒2型0RF2基因及其编码蛋白的研究概况，湖北畜牧兽医，2013, 34(1) :78-81)。
[0009] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个 体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该抗体的性质 不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌 合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有 抗原结合结构域的任何多肽。
[0010] 术语"抗体"应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗 原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双链抗体（diabodies)。融合至另一多肽 的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达 在 EP. A. 0120694 和 EP. A. 0125023 中描述。
[0011] 术语"抗体"可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异 性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决 定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A. 184187， GB2188638A或EP. A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或 其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
[0012] 用于本发明的"单克隆抗体"可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的 DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成 或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入 合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然 后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。
[0013] 在一个具体的实施方式中，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。
[0014] 在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒中还包括样品稀释液、洗涤液、 显色液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照。
[0015] 在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒中的所述样品稀释液为含有脱 脂奶的磷酸盐缓冲液，优选为含有10% (W/V)脱脂奶的磷酸盐缓冲液；
[0016] 所述洗涤液为含有Tween-20的磷酸盐缓冲液，优选为含有0? 05 % (V/V) Tween-20 的磷酸盐缓冲液；
[0017] 所述显色液包括显色液A和显色液B，所述显色液A含3, 3'，5, 5' -四甲基联苯 胺（TMB)20mg、无水乙醇10ml，并用ddH20定容至100ml ;所述显色液B含梓檬酸2. lg、无水 Na2HP042. 82g、0. 75% (V/V)的过氧化氢尿素 0. 64ml，并用 ddH20 定容至 100ml ;
[0018] 所述终止液为2mol/L H2S04。
[0019] 术语"磷酸盐缓冲液"是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化 学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐（包括但 不限于钠和钾盐）制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷 酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由 于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH 4至约pH 10的范围，优选约 pH 5至pH 9的范围，更有选约pH 6至约pH 8的范围，最优选约pH 7. 4。进一步优选地， 所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
[0020] 用于检测PCV2的ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
[0021] (1)克隆所述PCVlap全蛋白（如SEQ ID N0. 2所示的序列）的DNA(如SEQ ID NO. 1所不的序列），并进行蛋白质表达；
[0022] (2)利用所述Cap全蛋白免疫小鼠产生杂交瘤细胞，然后通过大量的筛选，得到性 能优良的分泌抗猪圆环病毒2型Cap全蛋白的单克隆抗体2F8和抗猪圆环病毒2型Cap全 蛋白的单克隆抗体3G12 ;其中，单克隆抗体2F8由保藏号为CCTCC NO :C2014199的杂交瘤 细胞分泌产生，单克隆抗体3G12由保藏号为CCTCC NO :C2014198的杂交瘤细胞分泌产生。
[0023] 在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒的制备方法还包括上述步骤 (2)之后的步骤（3):将步骤（2)所制得的单克隆抗体2F8在酶标板上进行包被；将单克隆 抗体3G12进行酶标记；
[0024] (4)配制样品稀释液、洗涤液、显色液A液、显色液B液、终止液、阳性猪血清对照以 及阴性猪血清对照；（5)将步骤（3)和/或（4)所制备的各成分组装成ELISA检测试剂盒。
[0025] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的所述ELISA检测试剂盒的制备方法 中，所述步骤（3)中包被时所用的包被液为碳酸盐缓冲液，优选为pH9. 6的碳酸盐缓冲液， 4°C包被过夜或37°C包被2小时，封闭时所用的封闭液为1% (W/V)BSA的磷酸盐缓冲液、 5% (W/V)脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1. 5% (V/V)明胶的磷酸盐缓冲液或5% (V/V)犊牛血 清FCS的磷酸盐缓冲液中的任一种，37°C封闭2小时，洗涤时所用洗涤液为含有Tween-20 的磷酸盐缓冲液，优选为含有0. 05% (V/V) Tween-20的磷酸盐缓冲液。
[0026] 本发明的所述ELISA检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
[0027] (1)将待检血清按100 y 1/孔加入包被有单克隆抗体2F8的酶标板上，37°C反应 60min，加入200 y 1/孔洗涤液洗3-5次，lmin/次，洗完后在吸水纸上拍干。
[0028] (2)将100 y 1/孔的1:8000倍（V/V)稀释的HRP标记的单克隆抗体3G12加入至 包被有单克隆抗体2F8的酶标板上，37°C反应60min，之后加入200 y 1/孔洗涤液洗3-5次， lmin/次，洗完后在吸水纸上拍干。
[0029] (3)加入底物显色液A和显色液B的混合液100 y 1/孔，室温避光放置15min。
[0030] (4)加入50 y 1/孔终止液以终止反应。
[0031] (5)在酶标仪上读取0D45。的值，并按照判定标准进行计算和判定。
[0032] 在一个具体的实施方式中，所述ELISA检测试剂盒的使用方法还包括：与上述步 骤（1)同时进行的步骤（I):将阴性猪血清对照、阳性猪血清按100 yl/孔加入包被有单克 隆抗体2F8的酶标板上，37°C反应60min，加入200 y 1/孔洗涤液洗3-5次，lmin/次，洗完 后在吸水纸上拍干。
[0033] 在一个具体的实施方式中，本发明提供的试剂盒为酶免疫层析检测试剂盒，其包 括缓冲液供应单元和检测单元，所述缓冲液供应单元用于将底物缓冲液供给所述检测单 J L 〇
[0034] 在一个具体的实施方式中，所述酶免疫层析检测试剂盒中，所述缓冲液供应单元 通过展开液垫用于将底物缓冲液供给所述检测单元；所述展开液垫的第一端与缓冲液供应 单元接触，所述展开液垫的第二端与所述检测单元的第一端接触。
[0035] 在一个具体的实施方式中，所述检测单元包括：
[0036] 基板；和在基板上依次设置的底物供应区、样品供应区和检测区；
[0037] 所述底物供应区包括底物垫，所述底物垫位于远离检测线方向的基板的一端，且 所述底物垫上吸附有酶