一种将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫检测领域，特别是涉及一种将紫杉醇类物质固定在固相载体 上的方法。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇（taxol)是一种四环二萜化合物，是细胞有丝分裂抑制剂，被用于癌症治 疗。紫杉醇属有丝分裂中的微管抑制剂，紫杉醇具有聚合和稳定细胞内微管的作用，致使快 速分裂的肿瘤细胞在有丝分裂阶段被牢牢固定，使微管不再分开，可阻断细胞于细胞周期 的G2与M期，使癌细胞复制受阻断而死亡。在癌症治疗中，患者组织中紫杉醇的含量对治 疗效果很关键，通常需要维持较低的水平。因为对细胞而言，紫杉醇浓度过大会导致正常细 胞大量死亡。因此，经常监测患者组织中紫杉醇的含量及代谢需要一种快速、灵敏的检测方 法。
[0003] 目前，紫杉醇的检测方法有紫外检测法、高效液相色谱法及竞争性抑制酶联免 疫法（Competitive Inhibition Enzyme Immunoassay，CIEIA)等，紫外检测法和高效 液相色谱法需要大量采集样品，且检测较慢、成本过高；CIEIA是利用酶联免疫原理，通 过显色反应，不经纯化，快速检测粗提混合物中紫杉醇的方法。Jaziri等用该方法可以 检测到植物组织及愈伤组织中l -l〇〇ng含量的紫杉醇（Jaziri等1991. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and the semi-quantitative determination of taxane diterpenoids related to taxol in Taxus sp. and tissue cultures. J Pharm Belg. 1991Mar_Apr ;46(2) :93_9)。利用该方法，Grothaus 等可以检测到血衆中 0? 3ng/ml 的紫杉酉享（Grothaus 等 1993. An enzyme immunoassay for the determination of taxol and taxanes in Taxus sp.tissues and human plasma. J Immunol Methods. 1993Jan 14 ； 158(1) :5-15.) 〇
[0004] 在现有的CIEIA检测紫杉醇的方案中，如图1所示，紫杉醇一般通过在吡啶溶液中 与琥珀酸酐反应，生成2-紫杉醇琥珀酰单酯，然后加入牛血清白蛋白（BSA)溶液及25%二 氧六环水溶液（v/V)，使2-紫杉醇琥珀酰单酯与BSA的氨基通过酰胺键结合形成BSA偶联 产物，通过BSA的吸附作用固定于微孔板1上，然后再通过CIEIA测定样品中紫杉醇的含 量。由于将紫杉醇固定在微孔板上的该方法步骤多，效率低、时间长，不能很好地满足经常 监测患者组织中紫杉醇的含量的需求。
【发明内容】
[0005] 为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种将紫杉醇类物质固定在固相载体 上的方法。
[0006] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
[0007] -种将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，所述固相载体的表面结合有马来 酸酐，所述方法为通过紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应，从而将所述紫杉醇类物质固定 在所述固相载体上。
[0008] 优选地，所述紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应包括如下步骤：
[0009] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇类物质和吡啶，在每毫升所述吡啶中，所 述紫杉醇类物质的含量为100-1000微克；
[0010] (2)将所述溶液加入所述固相载体，在反应温度为25-65°C下，所述紫杉醇类物质 的2' -羟基与马来酸酐反应至少8小时，形成2' -马来酸紫杉醇类酯。
[0011] 优选地，所述紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应包括如下步骤：
[0012] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇类物质和吡啶溶液，所述吡啶溶液包含吡 啶和能与所述吡啶互溶的溶剂，所述吡啶与溶剂的体积比大于等于1%且小于1〇〇%，在每 毫升所述吡啶溶液中，所述紫杉醇类物质的含量为100-1000微克；
[0013] (2)将所述溶液加入所述固相载体，在反应温度为25-65°C下，所述紫杉醇类物质 的2' -羟基与马来酸酐反应至少8小时，形成2' -马来酸紫杉醇类酯。
[0014] 紫杉醇在吡啶中，其较活跃的2' -OH和固相载体表面的马来酸酐反应，而7' -OH 由于空间结构的问题较不活跃，因此反应生成2' -马来酸紫杉醇类酯。
[0015] 优选地，所述紫杉醇类物质的含量为200-300微克。
[0016] 优选地，步骤（2)中，反应温度为50-60 °C。
[0017] 优选地，所述吡啶与溶剂的体积比为1-5 %。
[0018] 优选地，步骤（2)中的反应时间为30-40小时。
[0019] 优选地，步骤（1)中的所述溶剂为水、PBS缓冲液、甲醇、矿物油、甲醛、二甲基亚砜 和正己烷中的至少一种。
[0020] 优选地，所述紫杉醇类物质具有如下结构式：
[0021]
[0022]当1?1=(：6115，1?2=01 30)时，为紫杉醇；当1?1=(013)30)，1? 2=11时，为多烯紫杉醇。
[0023] -种用于检测紫杉醇类物质的中间体，包括固相载体和紫杉醇类物质，所述固相 载体的表面结合有马来酸酐，所述紫杉醇类物质通过与所述马来酸酐反应从而结合在所述 固相载体上。
[0024] 本发明的优点：本发明的方法是利用经马来酸酐活化的固相载体直接结合紫杉醇 类物质，从而可以直接进入后续的CIEIA检测步骤，该方法反应步骤少，干扰杂质少，反应 专一性强，和现有方法相比具有在紫杉醇类物质的检测中更加方便、快捷、灵敏、实用等优 点。
【附图说明】
[0025] 图1是现有技术中的紫杉醇通过BSA偶联产物固定到微孔板表面上的反应示意 图；
[0026] 图2是本发明实施例1中的紫杉醇固定在孔板上的反应示意图；
[0027] 图3是CIEIA检测待测样品中紫杉醇的含量的原理示意图；
[0028] 图4是本发明实施例2中在450nm下测定得到的光吸收曲线；
[0029] 图5是根据图4中的成线性的0. 05-5ng/mL浓度区间下制得的紫杉醇标准物在 0. 05_5ng/mL区间的工作曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0031] 本发明提供一种将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，在一种【具体实施方式】 中，所述固相载体的表面结合有马来酸酐，所述方法为通过紫杉醇类物质与所述马来酸酐 反应，从而将所述紫杉醇类物质固定在所述固相载体上。
[0032] 较优地，所述方法为通过通过紫杉醇类物质的2' _羟基与所述马来酸酐反应形成 2' -马来酸紫杉醇类酯。
[0033] 在一些较优的实施方式中，所述紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应包括如下步 骤：
[0034] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇类物质和吡啶，在每毫升所述吡啶中，所 述紫杉醇类物质的含量为100-1000微克；
[0035] (2)将所述溶液加入所述固相载体，在反应温度为25_65°C下，所述紫杉醇类物质 的2' -羟基与马来酸酐反应至少8小时，形成2' -马来酸紫杉醇类酯。
[0036] 在另一些较优的实施方式中，所述紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应包括如下步 骤：
[0037] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇类物质和吡啶溶液，所述吡啶溶液包含吡 啶和能与所述吡啶互溶的溶剂，所述吡啶与溶剂的体积比大于等于1%且小于100%，在每 毫升所述吡啶溶液中，所述紫杉醇类物质的含量为100-1000微克；
[0038] (2)将所述溶液加入所述固相载体，在反应温度为25-65°C下，所述紫杉醇类物质 的2' -羟基与马来酸酐反应至少8小时，形成2' -马来酸紫杉醇类酯。
[0039] 由于过高浓度的吡啶对有机塑料基质的固相载体材料有一定的腐蚀作用，从而影 响下面的反应，因此在加入固相载体前，再加入另一可以与吡啶互溶的溶剂以减小吡啶的 浓度，通过实验，吡啶与溶剂的体积比为1-5%时，既能使反应结果很好，又能防止吡啶对固 相载体的腐蚀。
[0040] 在以上优选实施方式中，紫杉醇类物质与马来酸酐的反应还受到反应温度的影 响，实验测试了在25°C、37°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C等温度下的反应结合效果，发现 在反应温度为50-60°C时，效果较优。
[0041] 同样地，反应时间也影响反应的效率，实验测试了 8小时、16小时、24小时、32小 时、40小时和48小时的反应，发现反应反应时间为30-40小时的效率较高。实验中也发现， 紫杉醇类物质的含量为200-300微克时较优。
[0042] 其中优选地：
[0043] 所述溶剂为水、PBS缓冲液、甲醇、矿物油、甲醛、二甲基亚砜和正己烷中的至少一 种。
[0044] 所述紫杉醇类物质具有如下结构式：
[0045]
[0046] 当札=(：6115，1?2=0130)时，为紫杉醇；当1? 1=(013)30)，1?2=11时，为多烯紫杉醇。
[0047] 固相载体可以是市售的已经用马来酸酐表面活化的用于ELISA的微孔板，如赛默 飞（Thermo Fisher Scientific Inc.)生产的 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 96孔板；也可以是常规的微孔板，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等 材质的微孔板，然后再在微孔板的表面用马来酸酐活化，使得马来酸酐结合连接在微孔板 上。较优的是米用商品名为 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 的 96 孔板。
[0048] 本发明还提供一种用于检测紫杉醇类物质的中间体，其包括固相载体和紫杉醇类 物质，所述固相载体的表面结合有马来酸酐，所述紫杉醇类物质通过与所述马来酸酐反应 从而固定在所述固相载体上。
[0049] 以下以紫杉醇为例，通过具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
[0050] 实施例1
[0051] 紫杉醇与固相载体 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 96 孔 板（以下简称孔板2)表面的结合，其反应示意图如图2所示。
[0052] 具体步骤如下：
[0053] (1)配制溶液，所述溶液中含紫杉醇物质、吡啶和溶剂，吡啶与溶剂的体积比为 2. 3%，在每毫升由吡啶和溶剂组成的液体中，紫杉醇物质的含量为233微克。
[0054] 具体为：称取10毫克紫杉醇，溶解于1毫升吡啶中，然后取其中的105微升与4395 微升甲醛（在其他实施例中，也可以为水、PBS缓