冲液、甲醇、矿物油、甲醛、二甲基亚砜或正 己烷或这些中的一种以上的混合），得到紫杉醇浓度为233微克/毫升的2. 3%吡啶/甲醛 的溶液。
[0055] (2)将上述溶液加入固相载体，在55°C下，所述紫杉醇与马来酸酐反应40小时，形 成2' -马来酸紫杉醇酯，从而将所述紫杉醇固定在所述固相载体上。
[0056] 具体为：
[0057] 取150微升的步骤⑴中的溶液加入孔板2的每个微孔中，封闭在密闭容器中，在 55°C条件下反应40h，从而将紫杉醇固定在孔板2的微孔中。
[0058] 为进行下述实施例中的工作曲线的绘制和样品中紫杉醇含量的测定试验，在步骤 (2)反应后，倒掉微孔中的反应液，洗涤后（可以采用PBS与非离子表面活性剂组成的缓冲 液进行洗涤，本例中采用1*PBST(PBS加0.05wt%吐温20)洗涤三次）即可通过CIEIA制作 紫杉醇标准物的工作曲线或测定样品中紫杉醇的含量。
[0059] CIEIA制作紫杉醇标准物的工作曲线或测定样品中紫杉醇的含量的原理如下：
[0060] 固定于微孔板上的紫杉醇可以和紫杉醇特异性抗体结合，然后通过二抗上的偶联 的标记酶（如辣根过氧化物酶），通过酶联显色反应，使无色底物（如TMB)产生有色化合 物（TMB。)，在一定范围内，该反应的颜色和微孔板表面结合的紫杉醇的浓度成线性关系，因 此可以通过测定反应液的光吸收，制作标准物的工作曲线，进行用于计算确定被测试物的 浓度。
[0061] CIEIA检测待测样品中紫杉醇的含量的原理如图3所示，具体为：在CIEIA中，在 微孔板上紫杉醇浓度一定的情况下，通过向微孔板上同时加入紫杉醇特异性抗体和含未知 量紫杉醇的待测样品，使得微孔板上紫杉醇和待测样品中的紫杉醇竞争性结合紫杉醇特异 性抗体，待测样品中的紫杉醇含量越高，竞争越强，而固定于微孔板上的紫杉醇结合的紫杉 醇特异性抗体数量就越少，通过洗涤洗去未结合于微孔板的紫杉醇特异性抗体以及待测样 品中的紫杉醇与紫杉醇特异性抗体的结合产物，然后在微孔内进行如上所述的酶联显色反 应，其颜色深浅和待测样品中的紫杉醇含量成反比，通过得到的标准物的工作曲线计算即 可以测定待测样品中紫杉醇的含量。
[0062] 实施例2
[0063] 采用CIEIA得到紫杉醇标准物的工作曲线，具体步骤如下：
[0064] 1)在实施例1的固定有紫杉醇的微孔中加入350微升封闭剂（本例中采用含 lwt%卵清蛋白的PBST溶液作为封闭剂），在20-30°C下进行封闭反应6小时。
[0065] 2)用含2wt %卵清蛋白的PBST溶液配制紫杉醇特异性抗体（本例中采用兔抗紫 杉醇多克隆抗体（Abeam, ab26953))和分别含以下浓度的紫杉醇：0、0. 04、0. 4、4、40、400纳 克/微升的紫杉醇标准液，其中，紫杉醇特异性抗体与含2wt %卵清蛋白的PBST溶液的体积 比为1:250。
[0066] 3)分别取150微升含不同浓度的紫杉醇的上述紫杉醇标准液加入步骤1)的微孔 中，在4°C下进行紫杉醇与紫杉醇特异性抗体的竞争抑制反应24h。反应完成后倒掉反应 液，并用350微升的PBST溶液洗涤3次。
[0067] 4)用含lwt %卵清蛋白的PBST溶液配制1:5000 (偶联了酶标记物的二抗与含1 % 卵清蛋白的PBST溶液的体积比）偶联了酶标记物的二抗（本例中采用偶联了辣根过氧化 酶的羊抗兔二抗），并取150微升加入步骤3)中的微孔中，在20-30°C下反应2小时。倒掉 反应液，并用350微升PBST溶液洗涤3次。然后向微孔中加150微升TMB(3, 3'，5, 5' -四 甲基联苯胺）底物反应液，在20-30°C下反应15-30分钟，或至有明显的颜色出现，加入 75微升2M的硫酸终止反应，在450nm下测定光吸收得到如图4所示的标准曲线，其中在 0. 05-5ng/mL浓度区间成线性，根据该成线性的区域绘制紫杉醇在0. 05-5ng/mL区间的紫 杉醇标准物的工作曲线，如图5所示，图5中显示，紫杉醇浓度与吸光度之间的关系满足y =-43. 522Ln(x)+25. 567,而线性回归系数接近1 (R2= 0. 9938)，说明该区间测得的数据可 与巨〇
[0068] 实施例3
[0069] 采用CIEIA测定样品中紫杉醇的含量，具体步骤如下：
[0070] S1、采集新鲜的红豆杉针叶，用清水洗净，于65°C烘箱内干燥至恒重，用粉碎机粉 碎，准确称取粉碎后的原料2g，置50mL磨口具塞三角瓶中，加入乙醇20mL，超声萃取30min， 留上清液，沉淀复加20mL乙醇，重复操作。合并上清液，过滤除渣，滤液于30°C减压蒸干得 浸膏，浸膏用20mL甲醇溶解，并加入1倍体积的石油醚，振荡30min，脱脂；萃取余液用三氯 甲烷（体积比2:1)振荡30min，褪色，若褪色不彻底应反复进行；再将萃取余液减压浓缩蒸 干（30°C )，用400 y L甲醇溶解得紫杉醇提取物，供CIEIA测试分析。
[0071] S2、将上述紫杉醇提取物用含2wt%卵清蛋白的PBST溶液稀释50, 000倍，并加入 1:250 (兔抗紫杉醇多克隆抗体与含2wt %卵清蛋白的PBST溶液的体积比）的兔抗紫杉醇 多克隆抗体（Abeam, ab26953)，作为待测样品。
[0072] S3、在实施例1的结合了紫杉醇的微孔中加入350微升含lwt%卵清蛋白的PBST 溶液，在20-30°C下进行封闭反应6小时。
[0073] S4、取150微升步骤S2中的待测样品加入步骤S3中的微孔中，在4°C下进行紫杉 醇与兔抗紫杉醇多克隆抗体的竞争抑制反应24h。反应完成后倒掉上述反应液，并用350微 升的PBST溶液洗涤3次。
[0074] S5、用含lwt %卵清蛋白的PBST溶液配制1:5000 (偶联了辣根过氧化酶的羊抗兔 二抗与含lwt%卵清蛋白的PBST溶液的体积比）偶联了辣根过氧化酶的羊抗兔二抗，并取 150微升加入步骤S4的微孔中，在20-30°C下反应2小时。倒掉反应液，并用350微升PBST 溶液洗涤3次。向微孔中加150微升TMB底物反应液，在20-30°C下反应15-30分钟，或至 有明显的颜色出现，加入75微升2M的硫酸终止反应，在450nm下测定光吸收，重复上述步 骤三次，测得数据如下表1所示。
[0075] 表1:CIEIA测定的各样品在450nm下的光吸收
[0077] S6、根据实施例2中得到的如图5所示的标准物的工作曲线，计算出待测样品中紫 杉醇的浓度为2. 803纳克/毫升，相当于未稀释前的紫杉醇提取物中的紫杉醇浓度为140. 1 微克/毫升。
[0078] 作为对照，通过UPLC(超高效液相色谱，Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)对步骤S1中的紫杉醇提取物进行直接测定，测得浓度为151. 2微 克/毫升，误差7. 34%。这说明CIEIA测定有很好的可靠性，但比UPLC等方法更灵敏（因 为稀释50, 000倍后仍可检测到）。因此，本发明的方法具有简单、方便、快捷、灵敏的特点， 可以应用于临床，且不需要从患者身上采集太多的样品，就可以监测癌症患者化疗期间组 织中紫杉醇浓度的变化，具有很好的应用价值。
[0079] 以上实施例是以紫杉醇为例进行的说明，各个实施例的方法对其他的紫杉醇类物 质，如多烯紫杉醇也同样适用。
[0080] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应 当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于：所述固相载体的表面 结合有马来酸酐，所述方法为通过紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应，从而将所述紫杉醇 类物质固定在所述固相载体上。2. 如权利要求1所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于，所述 紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应包括如下步骤： (1) 配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇类物质和吡啶，在每毫升所述吡啶中，所述紫 杉醇类物质的含量为100-1000微克； (2) 将所述溶液加入所述固相载体，在反应温度为25-65Γ下，所述紫杉醇类物质的 2' -羟基与马来酸酐反应至少8小时，形成2' -马来酸紫杉醇类酯。3. 如权利要求1所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于，所述 紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应包括如下步骤： (1) 配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇类物质和吡啶溶液，所述吡啶溶液包含吡啶和 能与所述吡啶互溶的溶剂，所述吡啶与溶剂的体积比大于等于1%且小于100%，在每毫升 所述吡啶溶液中，所述紫杉醇类物质的含量为100-1000微克； (2) 将所述溶液加入所述固相载体，在反应温度为25-65Γ下，所述紫杉醇类物质的 2' -羟基与马来酸酐反应至少8小时，形成2' -马来酸紫杉醇类酯。4. 如权利要求2或3所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于： 所述紫杉醇类物质的含量为200-300微克。5. 如权利要求2或3所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于： 步骤（2)中，反应温度为50-60 °C。6. 如权利要求3所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于：所述 吡啶与溶剂的体积比为1-5%。7. 如权利要求2或3所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于： 步骤（2)中的反应时间为30-40小时。8. 如权利要求3所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特征在于：步骤 (1)中的所述溶剂为水、PBS缓冲液、甲醇、矿物油、甲醛、二甲基亚砜和正己烷中的至少一 种。9. 如权利要求1~3任意一项所述的将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，其特 征在于：所述紫杉醇类物质具有如下结构式：当R1= C6H5, R2= CH3C0时，为紫杉醇；当R1= (CH3)3C0, R2= Η时，为多烯紫杉醇。10. -种用于检测紫杉醇类物质的中间体，其特征在于：包括固相载体和紫杉醇类物 质，所述固相载体的表面结合有马来酸酐，所述紫杉醇类物质通过与所述马来酸酐反应从 而固定在所述固相载体上。
【专利摘要】本发明公开了一种将紫杉醇类物质固定在固相载体上的方法，所述固相载体的表面结合有马来酸酐，所述方法为通过紫杉醇类物质与所述马来酸酐反应，从而将所述紫杉醇类物质固定在所述固相载体上。通过本发明的方法将紫杉醇类物质固定在固相载体上后，利用紫杉醇类物质的特异性抗体，根据竞争性抑制酶联免疫法原理可以测定样品中紫杉醇类物质的浓度。本发明的方法和现有方法相比具有在紫杉醇类物质的检测中更加方便、快捷、灵敏、实用等优点。
【IPC分类】G01N33/543
【公开号】CN105717286
【申请号】CN201410734480
【发明人】于为常, 张炜权
【申请人】香港中文大学深圳研究院
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年12月4日