一种用于伏马毒素b1灵敏检测的磁控比率荧光适配体传感器的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及材料学、光分析化学、纳米生物传感等领域，特指一种用于伏马毒素 B1 灵敏检测的磁控比率荧光适配体传感器的制备方法。
【背景技术】
[0002] 伏马毒素(Fumonisin)是由串珠镰刀菌、层生镰刀菌、轮枝镰刀菌等产生的次级代 谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三酸组成的结构类似的双酯化合物。人类迄今为止已 发现了 28种伏马毒素类似物，分为A、B、C和P族4类，其中在自然界中分布广泛、毒性较强的 是伏马毒素 B1 (Fumonisin B1，FB1) AB1污染的主要是玉米及其加工产品，此外还有一些如 大米、小米、高粱、牛奶、啤酒等食品。FBI可诱发人体食道癌、肝癌、胃癌的发生，并且FBI为 水溶性霉菌毒素，对热稳定，在多数食品加工过程中均比较稳定。为此，许多国家制订了相 应的限量标准，如欧盟规定婴幼儿玉米制品中FBI和FB2的总含量为0.2mg kg"1，玉米中的限 量值为4mg kg-S美国H)A规定玉米中FB1、FB2和FB3总量的最高限量值为2mg kg-、玉米是 人类赖以生存的主要粮食品种之一，全世界年产近5亿吨，其中我国居第二位，占总产量的 20%左右。我国所生产的玉米每年除满足国内需求外，还大量出口到其他国家。因此，建立 完善的伏马毒素检测手段和监控机制，及时有效地发现和控制有关伏马毒素的污染，及时 采取措施，从而提高中国玉米在国际市场上的质量、信誉和品牌，保证国际贸易的顺利进 行。
[0003] FBI现行的检测方法主要有薄层色谱法、近红外光谱法、酶联免疫吸附法、气相色 谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。其中薄层色谱法 和近红外光谱法灵敏度低且重现性较差，只能用于定性或半定量分析。而酶联免疫吸附法 假阳性率高，且对抗体的质量要求高，不能满足实验室分析要求。以气相色谱技术为基础对 目标物进行检测是目前公认的、准确检测FBI的仪器分析法。该法具有灵敏度高、分离能力 强、特异性好、测定结果可靠等优点;但也存在一定的局限，如需要专业的操作人员、分析周 期长、设备昂贵且需要特殊的测试环境，而且对样品的前处理要求严苛，常需要对样品进行 衍生化，不同操作过程所使用的化学药剂和处理途径差别较大，易对实验结果的精确度造 成影响，且谷物中的共提取物干扰严重。
[0004] 核酸适配体(Aptamer)是通过体外筛选技术，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到 的、能特异结合蛋白质或其它小分子物质的单链寡聚核苷酸。作为一种新型分子识别元件， 适配体一经发现便成为生物传感领域炙手可热的研究对象和分析工具。与抗体和酶等传统 的分子识别元件相比，适配体作用的靶分子范围更广，包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫 原性的物质；具有更高的特异性和亲和性;热稳定性好、维持活性的pH值和盐浓度范围广。 此外，适配体是由人工合成的，因而不依赖于动物或细胞，制备成本低、周期短，可以在合成 时定点、随意地连接其他功能基团和分子，具有较高的纯度和加工精确性。鉴于以上诸多优 势，近年来关于适配体的基础及应用研究均呈现了快速发展态势，是目前分析化学进展最 迅速的学科前沿之一。最近，相关研究人员设计了多个适配体传感体系，分别利用电化学、 微悬臂、荧光等研究手段，实现了对FBI的分析检测。比率荧光方法是基于两个不同波长的 荧光强度比值来达到分析检测目标物的方法。该方法在提高灵敏度和选择性方面有显著的 优势，近年来在生物和化学检测中引起了广泛关注。相比于传统的单波长荧光测量，比率荧 光传感器可以提供内部校正以消除环境因素，激发强度变化和探针浓度等因素的干扰，大 大减少误差，提高检测的准确性。目前报道的比率荧光传感器多以荧光染料或量子点为探 针，用于离子检测和生物分析等方面。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在发明一种具有工艺简单、成本低廉等优点的磁控比率荧光适配体传感 器，提供一种制备高选择性、高精确性，测量范围宽的高灵敏检测FBI的方法，解决现有检测 方法成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低、激发强度变化和探针浓度易受干 扰等难题。
[0006] 所采用的方案概括为：首先，在Si02表面静电吸附发射绿色荧光的CdTe量子点 (gQDs)制备Si〇2@gQDs，并将其作为荧光探针与FBI的Aptamer偶联;其次，以改进的st6ber法 合成Fe 3〇4@Si02磁性纳米微球(mSi02)，在mSi02表面静电吸附发射红色荧光的CdTe量子点 (rQDs)制得mSi〇2@rQDs，并将其作为磁性-焚光探针与aptamer的互补DNA(cDNA)偶联；最 后，利用Aptamer与cDNA之间的杂交反应将Si0 2@gQDs捕获在mSi〇2@rQDs制得mSi〇2@rQDs-cDNA/aptamer-gQDs@Si〇2磁控-焚光-分子革El向纳米生物复合物。该探针与目标物FBI作用 后，对其施加外源磁场分离富集未脱附的荧光信标，形成比率荧光适配体传感体系，实现对 FBI的灵敏检测。该比率荧光适配体传感方法可以提供内部校正，消除环境因素、激发强度 变化和探针浓度等因素的干扰，相比于单波长荧光检测，在提高灵敏度和精确度方面具有 非常显著的优势。
[0007] 本发明是通过如下具体技术方案实现的：
[0008] 一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1 (FBI)的方法，包括如下 步骤：
[0009] 步骤1、发射绿色荧光的水溶性CdTe量子点（简称为gQDs)水溶液和发射红色荧光 的水溶性CdTe量子点(简称为rQDs)水溶液的制备；
[0010 ]步骤2、单分散S i02纳米球分散液的制备；
[0011 ] 步骤3、Fe3〇4@S i 02磁珠 (mS i02)分散液的制备；
[0012] 步骤4、gQDs包覆的Si02 (简称为Si02@gQDs)分散液纳米球的制备:取步骤2制备的 Si02纳米球分散液和0.02M NaCl溶液溶解的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液于烧杯 中混合均匀，磁力搅拌反应;产物经离心分离、洗涤后，再加入步骤1中制备的gQDs水溶液， 于避光条件下磁力搅拌反应，经离心分离、洗涤后，避光自然干燥，将干燥后的产物分散到 蒸馏水中，得到Si0 2@gQDs分散液，备用；
[0013] 步骤5、rQDs包覆mSi02纳米球(简称为mSi02@rQDs)分散液的制备:取用步骤3中制 备的mSi02分散液，向其中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，机械搅拌反应;将产物磁性 分离，二次水洗3次后，加入二次水将其重新分散，制得聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的 mSi〇2(简称为mSi〇2_PDDA);最后，加入rQDs水溶液机械搅拌，经磁性分离，二次水洗后，避光 自然干燥，将干燥后的mSi02@rQDs分散在二次水中，得到mSi02@rQDs分散液，备用；
[0014] 步骤6、Si〇2@gQDs标记的Aptamer (简称为Si〇2@gQDs_Aptamer)焚光探针分散液的 制备:取步骤4制备的Si02@gQDs分散液，加入1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)水溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)水溶液，振荡反应，随后加入Aptamer储备液，振荡 孵育过夜，反应完毕后，离心洗涤产物，将产物重新分散在Tris-HCl溶液中，得到Si0 2@ gQDs-Aptamer分散液，备用；
[0015] 步骤 7、mSi〇2@rQDs 标记的 Aptamer 的互补链 cDNA (简称为 mSi〇2@rQDs_cDNA)磁性-荧光探针分散液的制备：取步骤5制备的mSi 02@rQDs的分散液，加入EDC水溶液和NHS水溶 液，振荡反应，加入cDNA，振荡孵育过夜，振荡孵育过夜，反应完毕后，离心洗涤产物，将产物 重新分散在Tris-HCl溶液中，得到mSi0 2@rQDs-CDNA分散液，备用；
[0016] 步骤8、传感器的构建及样品的检测，包括:磁控-比率荧光-靶向纳米生物复合物 的制备：取步骤6制备的Si02@gQDs-Aptamer荧光探针分散液和步骤7制备的mSi0 2@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液混合，进行第一次恒温振荡孵育，制得mSi02irQDs-cDNA/ Aptamer_gQDs@Si〇2 纳米生物复合物，对产物 mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2 纳米生 物复合物磁性分离、洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液A中，备用；
[0017] 对FBI标准品进行检测，建立标准曲线：取所制备的mSiC^OrQDs-cDNA/Aptamer-gQDsOSiCfe 纳米生物复合物与 FBI 溶液混合， 进行第二次恒温振荡孵育; 经磁性分离后 ，弃去 已脱附的Si〇2@gQDs，将收集得到的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2纳米生物复合物 洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液B中，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图，通 过荧光强度比（I g/Ir)/(Ig/Ir)()与FBI标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线，其中，（I g/ Ir)和（Ig/Ir)o分别为存在与不存在FBI时，磁性收集的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@ Si02纳米生物复合物所测得的gQDs荧光强度(Ig)和rQDs荧光强度(Ir)的比值；
[0018] 步骤9、对待测样按照步骤8同样的方法进行检测，依据步骤8得到的标准曲线得