s-cDNA磁 性-荧光探针分散液混合，进行第一次恒温振荡孵育，制得mSi0 2@rQDS-CDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2纳米生物复合物，对产物mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2纳米生物复合物 磁性分离、洗涤后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液A中，备用； 对FBI标准品进行检测，建立标准曲线：取所制备的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@ Si02纳米生物复合物与FBI溶液混合，进行第二次恒温振荡孵育；经磁性分离后，弃去已脱 附的Si〇2@gQDs，将收集得到的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2纳米生物复合物洗涤 后，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液B中，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图，通过荧 光强度比（I g/Ir)/(Ig/Ir)Q与FBI标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线，其中，（I g/Ir) 和（Ig/Ir)〇分别为存在与不存在FBI时，磁性收集的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2纳 米生物复合物所测得的gQDs荧光强度和rQDs荧光强度的比值； 步骤9、对待测样按照步骤8同样的方法进行检测，依据步骤8得到的标准曲线得出检测 数据。2. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤1中，发射绿色荧光的gQDs水溶液和发射红色荧光的rQDs水溶液的制 备方法为：称取0. 〇638g碲粉和0.0449g硼氢化钠置入10mL比色管中，加入4mL超纯水，通N2 除氧15min后置于4 °C冰箱中反应得到上清液呈紫色透明的碲氢化钠溶液；将 0.1142gCdCl2 · 2.5H20和75yL巯基丙酸加入到含50mL二次水的三颈瓶中，氮气氛下磁力搅 拌5min，用用2M NaOH调节溶液pH至8.5，迅速加入上述制备的他抓6溶液211^，继续搅拌 30min，100°C下回流0.5h和12h，回流0.5h后得到gQDs，回流12h后得到rQDs;停止反应恢复 至室温，加入100mL乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物避光自然干燥，再重新分散 得到1 Omg ml/1的gQDs水溶液和1 Omg ml/1的rQDs水溶液，4 °C避光保存，备用。3. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤2中，单分散Si02纳米球分散液的制备方法为:取一个经过严格清洗的 250mL单口烧瓶，分别加入80mL乙醇，4.85mL二次水和3.6mL 28wt%的氨水，55°C下搅拌反 应lOmin，然后将3. lmL正硅酸四乙酯TE0S与8mL乙醇的混合溶液迅速加入，55°C下搅拌反应 4h后，停止反应;产物离心水洗后，干燥，将干燥的产物转移至水中，制得浓度为10mg ml/1的 Si02纳米球分散液。4. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤3中，mSi02分散液的制备方法为：将10mL乙二醇，10mL-缩乙二醇，和 0.5536g FeCl3 · 6H20加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入1.5g醋酸钠和lg聚乙二醇并 使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200 °C下反应2h;冷却后，将混合物移至小 烧杯中，磁分离、乙醇洗涤5次，避光干燥后，将干燥后的产物转移至水中，制得浓度为20mg mL一 1的Fe3〇4纳米球分散液； 取5mL Fe3〇4纳米球分散液加入到100mL 1M的柠檬酸钠溶液中，室温下搅拌反应3h，随 后70°C下回流2h，磁分离去除清液，得到柠檬酸根修饰的Fe3〇4C-Fe3〇4;向制得的C-Fe 3〇4加 入0.5mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTS，搅拌反应3h，磁分离去除清液后，加入0.15mLTE0S， 10mL 28wt%的氨水和80mL乙醇，机械搅拌12h，磁分离、水洗多次，将制得的mSi02重新分散 在二次水中，得到mSi0 2的分散液，其质量浓度为10mg ml/1。5. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤4中，制备Si02@gQDs纳米球分散液时，所用的Si02纳米球分散液、聚二 烯丙基二甲基氯化铵溶液、gQDs水分散液的体积比为5:30:3;所用的聚二烯丙基二甲基氯 化铵溶液的浓度为0.4wt %，所制得的Si02@gQDs纳米球水分散液的浓度为10mg ml/1;所述 的搅拌反应均为3h。6. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤5中，制备mSi〇2@rQDs分散液时，所用的mSi〇2、聚二稀丙基二甲基氯化 铵、r Q D s水溶液的体积比为5 : 5 0 : 2 ;所用的聚二稀丙基二甲基氯化铵溶液的浓度为 0.4wt%，所制得的mSi〇2@rQDs分散液的浓度为10mg mL-1;加入聚二稀丙基二甲基氯化铵溶 液后的机械搅拌反应为lh，加入rQDs水溶液后的机械搅拌反应为3h。7. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤6中，制备Si02@gQDs-Aptamer荧光探针分散液时，所用的Si0 2@gQDs分 散液、EDC水溶液、NHS水溶液、Aptamer储备液的体积比为250:2 :1:1;所用的EDC溶液的浓度 为400mM，NHS溶液的浓度为200mM，所用的Aptamer储备液的浓度为100μΜ，所制得的Si〇2@ gQDs-Aptamer荧光探针分散液的浓度为10mg ml/1，所述的振荡反应时间为2h;Tris-HCl溶 液pH=7.4，浓度为1 OmM。8. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤7中，制备mSi02@rQDs-cDNA磁性-荧光探针分散液时，所用的mSi0 2@ rQDs的水分散液、EDC水溶液、NHS水溶液、cDNA储备液的体积比为250:2:1:1;所用的EDC溶 液的浓度为400mM，NHS溶液的浓度为200mM，所用的cDNA储备液的浓度为100μΜ，所制得的 mSi02@rQDs-CDNA磁性-荧光探针分散液的浓度为10mg mL-S所述的振荡反应时间为2h; Tris-HCl 溶液 ρΗ=7·4,浓度为 10mM。9. 根据权利要求1所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素 B1的方 法，其特征在于，步骤8中，制备磁控比率焚光传感器时，所用的Si〇2@gQDs-Aptamer焚光探 针分散液和mSi0 2@rQDs-CDNA磁性-荧光探针分散液的体积比为1:1，所制得mSi02@rQDs- CDNA/Aptamer-gQDS@Si02纳米生物复合物分散液的浓度为10mg mL-1;第一次恒温振荡孵育 的温度为37°C，时间为2h;第二次恒温振荡孵育的温度为37°C，时间为60min; Tris-HCl缓冲 溶液ΑρΗ = 7·4,浓度为 10mM，Tris-HCl 缓冲溶液A 中含有 120mMNaCl，20mMCaCl2,20mM MgCh和5mM KCl;Tris-HCl缓冲溶液Α ρΗ=7·4,浓度为 10mM; 在样品检测过程中，所用的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2纳米生物复合物、FBI 标准品溶液、磁性分离后重新分散的纳米生物复合物的体积比为1:1:40,所用的FBI标准品 溶液浓度为0~20000pg mL一、10. 根据权利要求1~9任意一项所述的一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏 马毒素 B1的方法，其特征在于，所用的Aptamer序列为:5'-NH2-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3'；cDNA序列为：5'-NH2-AGA TTG CAC TTA CTA TCT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG CAG ACG TAA TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGA ATA AGC TGG TAT-3 '。
【专利摘要】本发明提供了一种用磁控比率荧光适配体传感器灵敏检测伏马毒素B1的方法，包括如下步骤：发射绿色荧光的CdTe量子点水溶液和发射红色荧光的CdTe量子点水溶液的制备；SiO2纳米球分散液的制备；Fe3O4SiO2磁珠分散液的制备；gQDs包覆的SiO2分散液的制备；rQDs包覆mSiO2纳米球分散液的制备；SiO2gQDs标记的Aptamer荧光探针分散液的制备；mSiO2rQDs标记的cDNA磁性?荧光探针分散液的制备；传感器的构建及样品的检测；对待测样进行检测。本发明研制的磁控比率荧光适配体传感器，加工方法简便、检测成本低，可以提供内部校正以消除环境因素、激发强度变化和探针浓度等因素的干扰，大大减少误差，提高FB1检测的准确性和灵敏性。
【IPC分类】G01N21/64, G01N33/53
【公开号】CN105717285
【申请号】CN201610086296
【发明人】钱静, 华梦娟, 王坤, 王成全, 刘倩, 郝楠
【申请人】江苏大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年2月15日