专利名称：黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及检验检疫领域，特别涉及检测黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮的试剂盒， 另外还涉及试剂盒的制法。
背景技术：
真菌毒素是真菌产生的对人类和动物等有致病影响的一类次生代谢产物。真菌毒素种类繁多，目前已知的就多达200多种，主要包括黄曲霉毒素(AF)，玉米赤霉烯酮(ZEN， 又称F-2毒素)，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，赭曲霉毒素，伏马菌素(FBI，FB2)等。在这些毒素中，黄曲霉毒素是上世纪六十年代初发现的，是世界上报道最早并且是迄今研究最为深入的一种真菌毒素，而后几种毒素则不仅发现相对较晚，在检测技术研究方面也相对滞后。真菌毒素广泛存在于农副产品，食品和动物饲料中。农作物在生长，收割，加工及运输中都会暴露或接触到产毒真菌，从而受到侵染，导致农产品和饲料品质降低，严重时还会影响到农作物的产量。全世界每年由于霉变污染真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿美元。误食被真菌毒素污染的食品后可引起中毒，如胃肠道症状恶心，呕吐，腹胀，腹痛等；肝、肾、神经、血液等系统的损害肝功异常，血尿，蛋白尿，中性粒细胞减少或缺乏等；严重者可导致癌症。食品安全是当今世界一个重要的主题，真菌毒素的研究与食品安全息息相关，已经越来越受到全世界的重视。在真菌毒素的检测方法方面，各国研究人员取得了很大的成就，但还没有建立起一个完善的真菌毒素检测技术体系，因此也还不能保证完全检出和杜绝被毒素污染的产品进入餐桌或进出口。真菌毒素的检测方法很多，概括起来有生物鉴定法、物理化学法及免疫分析法等。生物鉴定法检测结果直观，但其专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证。传统的用于检测真菌毒素的物理化学方法有薄层层析法 (TLC)，气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。其中，TLC法比较经济，对设备和人员要求较低，但其精确度低、操作过程复杂、分析结果的可重复性和再现性差；GC法的变异系数较大；HPLC法的灵敏度和特异性好，但操作烦琐，仪器设备要求高，检测成本高，结合使用免疫亲和柱，虽可增加使用的方便性，但检测费用更高，一般只适合于科研机构或确证试验。新近发展起来的真菌毒素物理化学检测方法有近红外光谱分析法，高效液相联合电喷质谱法，气相色谱联合质谱法和表面等离子体共振法等方法。这些方法具有较高的准确性，灵敏度和特异性，但都需要应用贵重的分析仪器，而且操作复杂；样品提取净化步骤、样品制备和前处理要求较高而使检测成本增加；测定时间长，单位时间内检测样品数量有限并且需要专业技术人员来完成操作。近年来，免疫检测技术作为一种新技术已在农业和生物科学上有了一定的应用， 而且表现出了具有满足各类检测要求的无限发展前景。目前，免疫检测技术在真菌毒素快速检测领域的应用主要集中在酶联免疫吸附测定法(ELISA)等快速分析法方面，已有相应的国家标准和试剂盒，技术专利发布。ELISA检测技术是一种较理想的检测方法，但在重复性，定量性和灵敏度方面还有亟待改进和提高的地方。液相芯片(又称多功能悬浮点阵仪)检测技术是20世纪90年代中期美国Luminex 公司开发出的芯片技术，此技术将流式检测技术与芯片技术有机地结合在了一起，它既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持，又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。液相芯片系统的核心技术是该系统由许多直径约为5. 6微米的羧基化微球构成。这些微球在制备过程中掺入了两种不同的红色荧光素分子，根据这两种红色分类荧光素的比例不同，微球被分为100种；然后通过共价方式，将针对不同检测物的寡核苷酸或蛋白质探针吸附到100种微球上，并在连有探针的微球上结合另一种绿色荧光素报告分子；检测时，双色激光将同时对红色分类荧光和绿色报告荧光进行检测，以区分不同的分析反应并确定微球上结合的目的分子数量。液相芯片检测技术被认为是现阶段最佳的检测技术，其优点有1)高通量性可以对一个样本中的多种不同目的分子同时进行检测，在35飞0 min内可对96个不同样本进行检测；2)在保持高通量检测的同时，液相芯片技术将固相芯片中的“液相-固相”反应体系改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，有利于保持蛋白质的天然构象，从而更有利于探针和被检测物的反应；3)灵活性大不仅适用于各种蛋白质分析，也适用于核酸分析，同时还可根据需要调节每次检测所需要的微球数量、调整检测体系设计；4)信噪比好，敏感性高每个微球上都以共价结合的方式包被了许多抗原、抗体或核酸分子，因参与反应的分子多，产生的信号就强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于现有的任何检测方法，只需要微量的检测样品即可进行检测；5)重复性好一方面液相芯片反应发生在均相液体环境中，稳定性较好，另一方面每个指标所在的反应体系中有1000-5000个相同的微球，检测时，抽取其中的100-500个微球进行读数，最终的数据是取其平均值，因此使误差减小到了最小；6)检测速度快液相芯片反应在悬浮的液相中进行，而反应后通常不需要清洗就可以直接读数，因此检测时间较短，所用时间从几小时缩短到了十几分钟。液相芯片具有广阔的应用领域，蛋白质定量研究、蛋白质功能分析研究和蛋白质表达谱分析等均可应用。目前该技术的主要应用有1)细胞因子的检测液相芯片技术可自行选择所需要检测的细胞因子/趋化因子的种类和数目，在短时间内对微量样本中的多种待测物进行检测；2)免疫分析液相芯片利用50 μ L血清、血浆或组织培养物上清样本， 就可以对人、大鼠、小鼠的蛋白质进行分析，4小时即可完成；3)单核苷酸多态性(SNP)检测液相芯片检测技术检测线粒体DNA的SNP，得到的结果与传统方法的一致，与传统方法比较，该技术操作简单，快速，重复性好；4)免疫球蛋白分型液相芯片技术可在1小时内得到免疫球蛋白分型结果；5)疾病的诊断。液相芯片技术集“高通量、灵敏、快速和准确”于一体，但在抗体对的匹配，交联条件的最优化，多种反应混合交叉反应的避免和数据处理等方面还存在不足。目前液相芯片检测技术在真菌毒素检测方面未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，而且可以同时检测两种毒素，检测灵敏度高。本发明的另一目的是提供试剂盒的制法，方法简单，易于操作实施。
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本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种黄曲霉毒素Bl、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，试剂盒内分别装有缓冲液、黄曲霉毒素Bl-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶联微球、生物素标记AFBl多克隆抗体和/或ZEN单克隆抗体、不同浓度倍比稀释 AFBl标准品和/或不同浓度倍比稀释^N标准品。所述缓冲液可以选用0.IM PBS, pH 7. 4 或 50 mM HEPES, pH 7. 4 或 20 mM MOPS, pH 7. 2 或 50 mM MES, pH 6. 5。所述微球可以选用Luminex 1_100号羧基化微球。所述AFBl多抗临界饱和浓度为0-6. Ong/ μ L ；ZEN单抗临界饱和浓度为 0-2. 0μ g/mL。本发明一种黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片二重检测试剂盒的制法
第一步微球偶联偶联操作参照Luminex偶联操作说明书进行，取观号微球和36号微球各ΙΟΟμ ，分别偶联AFBl-BSA和ZEN-BSA各IOOPg ；
偶联质控取28号和36号微球各ΙΟμ ，分别偶联生物素标记兔抗羊IgG各10μβ ； A 计算微球得率取上述悬浮微球，4PL /管，用微球保存液稀释至125PL，采用血球计数板在光学显微镜下进行微球计数；每个离心管取3份样品进行计数，并取其平均值，用该平均值根据计算公式(1)和(2)计算偶联微球得率，偶联微球得率符合Luminex操作要求； 偶联微球数量(个)=(平均值/4) XlO4X (125/4) Χ0. 1···公式(1) 偶联微球得率=[偶联微球数量/ (6. 25Χ105)]Χ100%……··公式(2) B 检测偶联微球质量包括空白质控、阴性质控、偶联质控检测， 空白质控取原始观号和36号微球各10μ ，分别加入到1. 5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μ ，分别加入微球封闭液，25μ 7管，混勻，37°C避光孵育30min ；
阴性质控取偶联AFBl-BSA的28号微球以及^N-BSA偶联36号微球各10μ ，分别加入到1. 5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μ ，分别加入4gg/mL SAPE, 25μ /管，混勻，37 °C避光孵育30min ；
偶联质控取偶联生物素标记兔抗羊IgG的28号和36号微球各10μ ， 分别加入到1.5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μ ，分别加入4Pg/mL SAPE， 25μ /管，混勻，37°C避光孵育30min ；分别取75μ1上述30min孵育产物，加入液相芯片系统中进行测试；
判断标准液相芯片偶联实验结果应同时满足以下三个条件1)空白质控MFI低于50 ； 2)阴性质控MFI低于100 ；3)偶联质控MFI要求高于1000，并远大于Cutoff值，偶联微球质量符合质量判断标准，备用； 第二步标记抗体生物素
严格按照Pierce生物素标记试剂盒(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit)操作说明书进行，质量控制要求， A500H\A ^ 0. 9-1. 3 ； A500H\A\B ^ 2. 0-3. 0 ；
抗体生物素标记符合EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit质量标准，备用； 第三步确定抗体临界饱和浓度
在1. 5mL的离心管中按表3依次加入36#100偶联微球、28#100偶联微球、生物素标记ZEN单克隆抗体、生物素标记AFBl多克隆抗体，最后用PBS补足体积至ΙΟΟμ ；每个反应体系重复配制3个；混勻，避光37°C孵育Mh ；配制4Pg/mL SA-PE ；向每个离心管里加25μ ^gML SA-PE ；混勻，37°C避光孵育30min ；取上述反应液，75μ1/反应体系，加入液相芯片中测试；用EXCEL软件对实验结果求平均值，并将抗体浓度和其对应的荧光信号值绘制散点图，根据散点图呈现趋势，选取线性关系较好的点进行直线拟合，求其R2，最R2对应的抗体浓度即为临界饱和浓度。 本发明AFBl和ZEN液相芯片多重定量检测方法，包括建立标准曲线和样品添加回收试验
(1)标准曲线的建立
在1. 5ml的离心管中按表1依次加入36#100微球、28#100微球、AFBl标准溶液和ZEN 标准溶液、生物素标记AFBl多克隆抗体、生物素标记ZEN单克隆抗体，最后用PBS补足体积至IOOPL ；每个反应体系重复配制3个；混勻，避光37°C孵育Mh ；配制4gg/mL SA-PE ；向离心管中加入4Pg/mL SA-PE，25PL/管；混勻，37°C避光孵育30min ； 取上述反应液，75μ1/反应体系，加入液相芯片中测试；
表1.标准曲线反应体系
权利要求
1.一种黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是试剂盒内分别装有缓冲液、黄曲霉毒素Bl-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶联微球、生物素标记AFBl多克隆抗体和/或ZEN单克隆抗体、不同浓度倍比稀释AFBl标准品和/或不同浓度倍比稀释 ZEN标准品。
2.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是所述缓冲液选用0. IM PBS, pH 7. 4 或 50 mM HEPES, pH 7. 4 或 20 mM MOPS, pH 7. 2 或 50 mM MES, pH 6. 5。
3.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是所述微球选用=Luminex 1-100号羧基化微球。
4.根据权利要求1一 3任一所述的一种黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，其特征是缓冲液中悬浮有分别偶联黄曲霉毒素Bl-BSA和玉米赤霉烯酮-BSA的微球，黄曲霉毒素Bl-BSA多抗临界饱和浓度为0-6. Ong/ μ L ；玉米赤霉烯酮-BSA单抗临界饱和浓度为0-2. 0μ g/mL。
5.一种黄曲霉毒素Bi、玉米赤霉烯酮液相芯片二重检测试剂盒的制法第一步微球偶联偶联操作参照Luminex偶联操作说明书进行，取观号微球和36号微球各ΙΟΟμ ，分别偶联AFBl-BSA和ZEN-BSA各IOOPg ；偶联质控取28号和36号微球各ΙΟμ ，分别偶联生物素标记兔抗羊IgG各10μβ ； A 计算微球得率取上述悬浮微球，4PL /管，用微球保存液稀释至125PL，采用血球计数板在光学显微镜下进行微球计数；每个离心管取3份样品进行计数，并取其平均值，用该平均值根据计算公式(1)和(2)计算偶联微球得率，偶联微球得率符合Luminex操作要求； 偶联微球数量(个)=(平均值/4) XlO4X (125/4) Χ0. 1···公式(1) 偶联微球得率=[偶联微球数量/ (6. 25Χ105)]Χ100%……··公式(2) B 检测偶联微球质量包括空白质控、阴性质控、偶联质控检测， 空白质控取原始观号和36号微球各10μ ，分别加入到1. 5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μ ，分别加入微球封闭液，25μ 7管，混勻，37°C避光孵育30min ；阴性质控取偶联AFBl-BSA的28号微球以及^N-BSA偶联36号微球各10μ ，分别加入到1. 5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μ ，分别加入4gg/mL SAPE, 25μ /管，混勻，37 °C避光孵育30min ；偶联质控取偶联生物素标记兔抗羊IgG的28号和36号微球各10μ ， 分别加入到1.5 mL离心管中，并用偶联缓冲液稀释至100μ ，分别加入4Pg/mL SAPE， 25μ /管，混勻，37°C避光孵育30min ；分别取75μ1上述30min孵育产物，加入液相芯片系统中进行测试；判断标准液相芯片偶联实验结果应同时满足以下三个条件1)空白质控MFI低于50 ； 2)阴性质控MFI低于100 ；3)偶联质控MFI要求高于1000，并远大于Cutoff值，偶联微球质量符合质量判断标准，备用； 第二步标记抗体生物素严格按照Pierce生物素标记试剂盒(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit)操作说明书进行，质量控制要求， A500H\A ^ 0. 9-1. 3 ；A500H\A\B ^ 2. 0-3. 0 ；抗体生物素标记符合EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit质量标准，备用；第三步确定抗体临界饱和浓度在1. 5mL的离心管中按表3依次加入36#100偶联微球、28#100偶联微球、生物素标记 ZEN单克隆抗体、生物素标记AFBl多克隆抗体，最后用PBS补足体积至ΙΟΟμ ；每个反应体系重复配制3个；混勻，避光37°C孵育Mh ；配制4Pg/mL SA-PE ；向每个离心管里加25μ ^gML SA-PE ；混勻，37°C避光孵育30min ；取上述反应液，75μ1/反应体系，加入液相芯片中测试；用EXCEL软件对实验结果求平均值，并将抗体浓度和其对应的荧光信号值绘制散点图，根据散点图呈现趋势，选取线性关系较好的点进行直线拟合，求其R2，最R2对应的抗体浓度即为临界饱和浓度。
全文摘要
本发明涉及检验检疫领域。一种黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒，试剂盒内分别装有缓冲液、黄曲霉毒素B1-BSA和/或玉米赤霉烯酮-BSA偶联微球、生物素标记AFB1多克隆抗体和/或ZEN单克隆抗体、不同浓度倍比稀释AFB1标准品和/或不同浓度倍比稀释ZEN标准品。本发明试剂盒采用竞争法原理和液相芯片技术平台，不仅能同时检测两种毒素，而且大大提高了检测灵敏度。本试剂盒特点主要有以下几点样品提取操作简单，回收率(>75%)；高灵敏度(0.03ng/mL)；黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮液相芯片二重检测；适用于大批量样品的高通量检测。
文档编号G01N33/532GK102401832SQ201110253830
公开日2012年4月4日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者刘淑艳, 宋慧君, 蒋丹, 马惠蕊 申请人:刘淑艳, 宋慧君, 蒋丹, 马惠蕊