专利名称：一种黄曲霉毒素b1的免疫学检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及动物性食品安全和畜牧业生产中毒素残留检测的试剂盒，特别是一种用于检测动物性食品和饲料生产中黄曲霉毒素BI的免疫学检测试剂盒。
背景技术：
黄曲霉毒素是一类真菌(如黄曲霉 和寄生曲霉)的有毒代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液、动物饲料相关的产品中。黄曲霉毒素(AFT)目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素BI (AFBl)的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。黄曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素BI的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。当哺乳动物摄入黄曲霉毒素BI污染的饲料后，在体内经羟基化会将黄曲霉毒素Ml分泌于乳汁当中，奶牛经摄入黄曲霉毒素BI污染的饲料后产出的牛奶中便含有黄曲霉毒素Ml。由于黄曲霉毒素Ml相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其消除，所以检测黄曲霉毒素Ml不仅要检测动物饲料原料，而且要检测最终产品。为此世界各国都规定了牛乳及其制品中黄曲霉毒素Ml的最大允许含量并将其作为强制性标准，如中国政府规定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、奶油等)中黄曲霉毒素Ml的最闻允许含量为O. 5ng/ml。现有技术中常用的黄曲霉毒素残留检测主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫学分析法等。采用理化分析方法虽然是一种较理想的药物残留分析方法，但黄曲霉毒素BI分子中没有紫外发光团和荧光团，在化学分析中需要将它转变为具有紫外发光团或荧光团的衍生物才能进行分析，这给检测工作带来了极大困难，而且具有样品前处理步骤繁琐，耗时费力，仪器价格昂贵，需要专业人员操作等缺点。免疫学分析法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、能进行批量检测等优点。ELISA检测是常用的免疫学分析方法，但国内用于药物残留检测的研究较少，用于检测黄曲霉毒素BI的ELISA试剂盒更是一项空白。
发明内容本实用新型的目的是提供了一种小巧轻便的黄曲霉毒素BI的免疫学检测试剂盒，使用该试剂盒操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，可进行一次连续多个样品中黄曲霉毒素BI的检测。本实用新型的技术方案是一种黄曲霉毒素BI的免疫学检测试剂盒，包括盒体，其特征在于盒体内包含有酶标板、盖板膜、14瓶试剂和具有下凹瓶位的模具，所述的酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，微孔条上预包被黄曲霉毒素BI偶联抗原后固定于酶标板的外框支撑架上，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；所述的盖板膜大小与酶标板一致；所述的模具上的下凹瓶位分别为标准液瓶位、高浓度标准液瓶位、酶标二抗工作液瓶位、黄曲霉毒素BI抗体瓶位、显色液A液瓶位、显色液B液瓶位、终止液瓶位、浓缩洗涤液瓶位、浓缩样品稀释液瓶位。所述的盒体是硬纸盒；所述的酶标板由聚苯乙烯制成，放于真空铝钼袋内；所述的盖板膜是透明塑料硬膜，放于铝钼袋内；所述的14瓶试剂分别为6瓶标准液、I瓶高浓度标准液、I瓶酶标二抗工作液、I瓶黄曲霉毒素BI抗体、I瓶显色液A液、I瓶显色液B液、I瓶终止液、I瓶浓缩洗涤液、I瓶浓缩样品稀释液，标准液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛装，酶标二抗工作液用红色瓶帽的白色塑料瓶盛装，黄曲霉毒素BI抗体用黄色瓶帽的白色塑料瓶盛装，显色剂A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛装，显色剂B液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，终止液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，浓缩洗涤液和样品稀释液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛装；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14个下凹瓶位，14个试剂瓶依次放入对应下凹瓶位内。所述的6瓶标准液,均为lml/瓶,浓度分别为0ng/ml,0. 02ng/ml,0. 06ng/ml,O. lng/ml,0. 3ng/ml,0. 8ng/ml ;高浓度标准品溶液I瓶，lml/瓶；酶标二抗工作液I瓶，6ml/瓶；黄曲霉毒素BI抗体工作液I瓶，6ml/瓶；显色液A液I瓶，7ml/瓶；显色液B液I瓶，7ml/瓶；终止液I瓶，7ml/瓶；浓缩洗涤液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；浓缩样品稀释液(2X) I 瓶，40 ml/瓶。本实用新型用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书和质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96份测定(包括标准分析孔)，即可进行一次连续多个样品 的检测，也可将酶标板微孔条拆开进行多次使用。此时，将剩下的微孔条放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性和稳定性。检测时，样本中的残留物黄曲霉毒素BI将和微孔条上预包被的黄曲霉毒素BI偶联抗原竟争抗黄曲霉毒素BI抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素BI的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物黄曲霉毒素BI的含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很闻的灵敏度最低检测限为O. 02ng/ml,回收率花生、玉米等谷物类为90± 15%、饲料样品为85± 15%、食用油为90± 15%、鲜奶类及其制品为92±15%，且试剂盒的变异系数均小于10%。相对于其他检测黄曲霉毒素BI残留的方法，本试剂盒所需要的仪器较少，只需要酶标仪、匀质器、振荡机和微量加样器，同类实验室一般均有配备，操作简单易行，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源性食品中黄曲霉毒素BI残留的定量、定性检测。
图I是本实用新型中酶标板的主视图；图2是图I中沿A-A的纵向剖视图；图3是本实用新型盖板膜的主视图；图4是本实用新型中试剂瓶的主视图；图5是本实用新型中具有下凹瓶位模具的结构示意图；图6是本实用新型中放入下凹瓶位模具盒体的结构示意图。图面说明1、支撑架；2、微孔条；3、黄曲霉毒素BI偶联抗原；4、盖板膜；5、白色瓶帽；6、半透明塑料试剂瓶；7、黄色瓶帽或红色瓶帽；8、黑色瓶帽；9、黑色塑料试剂瓶；10、绿色瓶帽；11、白色塑料试剂瓶；12、白色瓶帽；13、6ml黄曲霉毒素BI抗体工作液瓶位；14、6ml酶标二抗工作液瓶位；15、7ml底物显色剂A液瓶位；16、Iml高浓度黄曲霉毒素BI标准品溶液瓶位；17、7ml底物显色剂B液和7ml终止液瓶位；18、lml/瓶各种浓度的标准液瓶位；19、40ml浓缩洗涤液瓶位；20、40ml浓缩样品稀释液瓶位；21、具有下凹瓶位的模具；
22、盒体。
具体实施方式
结合附图详细描述实施例。酶标反应微孔条(2)预包被黄曲霉毒素BI偶联抗原
(3)后固定于酶标板的外框支撑架(I)上，且酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2 );白色瓶帽(5 )的半透明塑料试剂瓶(6)用于封装40ml浓缩洗涤液或40ml浓缩样品稀释液；黄色瓶帽(7)的白色塑料试剂瓶用于封装6ml黄曲霉毒素BI抗体工作液，红色瓶帽(7)的白色塑料试剂瓶用于封装6ml酶标二抗工作液；黑色瓶帽(8)的黑色塑料试剂瓶(9)用于封装7ml底物显色剂A液，绿色瓶帽(10)的白色塑料试剂瓶(11)用于封装7ml底物显色剂B液或7ml终止液；白色瓶帽(12)的半透明塑料试剂瓶用于封装lml/瓶的标准品溶液；实用新型盒体(22)内置新型·具有下凹瓶位的模具(21)，上有14个瓶位，放置位置依次为6ml黄曲霉毒素BI抗体工作液瓶位(13)，6ml酶标二抗工作液瓶位(14)，7ml底物显色剂A液瓶位(15)，Iml高浓度黄曲霉毒素BI标准品溶液瓶位(16)，7ml底物显色剂B液和7ml终止液瓶位(17)，6种lml/瓶各种浓度的标准液瓶位(18)，40ml浓缩洗涤液瓶位(19)，40ml浓缩样品稀释液瓶位(20)。动物饲料样品中黄曲霉毒素BI含量的测定I)样本前处理取3g粉碎饲料样品，加入9ml样品提取液；剧烈振荡IOmin ；4000r/min离心5min,或用定量分析滤纸过滤；上清液或滤液用去离子水按1:9比例稀释(I份滤液+9份去离子水)；取稀释后液体待测。稀释倍数30倍。2)使用试剂盒的操作步骤①将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20 25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀取出需要数量的微孔条，将不用的微孔条放进原铝箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2 8°C 洗涤工作液在使用前也需回温；④编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置； 加标准品/样本加标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，随即加入酶标二抗工作液50 μ I /孔，再加入黄曲霉毒素BI抗体工作液50μ1 /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37°C避光环境中反应30min;⑥洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μ I/孔，充分洗涤5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破) ’⑦显色加入底物显色剂A液50 μ I/孔，再加底物显色剂B液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境反应15 20min ’⑧测定加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。3)结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，而定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含黄曲霉毒素BI成负相关。①用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围。假设样本I的吸光度值为O. 659，样本2的吸光度值为I. 525，标准液吸光度值分别是0ng/ml为2. 101 ；O. 02ng/ml 为 I. 738 ；0. 06ng/ml 为 I. 313 ；0. lng/ml 为 O. 831 ；0. 3ng/ml 为 O. 262。则样本I的浓度范围是O. lng/ml O. 3ng/ml ;样本2的浓度范围是O. 02ng/ml O. 06ng/ml,再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中黄曲霉毒素BI的浓度范围。②准确定量计算分两个步骤第一步，百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，S卩百分吸光度(％)= B/B0 X 100%式中，B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值Atl-OngAil标准溶液的平均吸光度值。第二步，标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素BI标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素BI实际含量。4)注意事项①室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20 25°C )会导致所有标准的OD值偏低；②在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作；③每加一种试剂前需将其摇匀；④反应终止液为浓度2 mol/1硫酸,避免接触皮肤；⑤不使用过有效日期的试剂盒；不使用过有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂；⑥保存试剂盒于2 8°C，不可冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂(底物液)对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；⑦试剂变质的迹象底物液有任何颜色表明变质，应当弃之。O标准的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5)时，表示试剂可能变质；⑧在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15 20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到30min (或更长)。反之，则减短反应时间；⑨浓缩洗涤液如有结晶属正常现象，请加热溶解后使用；⑩该试剂盒最佳反应温度为37°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
权利要求1.一种黄曲霉毒素BI的免疫学检测试剂盒，包括盒体，其特征在于盒体内包含有酶标板、盖板膜、14瓶试剂和具有下凹瓶位的模具，所述的酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，微孔条上预包被黄曲霉毒素BI偶联抗原后固定于酶标板的外框支撑架上，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；所述的盖板膜大小与酶标板一致；所述的模具上的下凹瓶位分别为标准液瓶位、高浓度标准液瓶位、酶标二抗工作液瓶位、黄曲霉毒素BI抗体瓶位、显色液A液瓶位、显色液B液瓶位、终止液瓶位、浓缩洗涤液瓶位、浓缩样品稀释液瓶位。
2.根据权利要求I所述的黄曲霉毒素BI的免疫学检测试剂盒，其特征在于所述的盒体是硬纸盒；所述的酶标板由聚苯乙烯制成，放于真空铝钼袋内；所述的盖板膜是透明塑料硬膜，放于铝钼袋内；所述的14瓶试剂分别为6瓶标准液、I瓶高浓度标准液、I瓶酶标二抗工作液、I瓶黄曲霉毒素BI抗体、I瓶显色液A液、I瓶显色液B液、I瓶终止液、I瓶浓缩洗涤液、I瓶浓缩样品稀释液，标准液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛装，酶标二抗工作液用红色瓶帽的白色塑料瓶盛装，黄曲霉毒素BI抗体用黄色瓶帽的白色塑料瓶盛装，显色剂A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛装，显色剂B液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，终止液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，浓缩洗涤液和样品稀释液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛装；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14个下凹瓶位，14个试剂瓶依次放入对应下凹瓶位内。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素BI的免疫学检测试剂盒，其特征在于所述的6瓶标准液，均为 lml/ 瓶，浓度分别为 Ong/ml, O. 02ng/ml, O. 06ng/ml, O. lng/ml, O. 3ng/ml,.0.8ng/ml ;高浓度标准品溶液I瓶，lml/瓶；酶标二抗工作液I瓶，6ml/瓶；黄曲霉毒素BI抗体工作液I瓶，6ml/瓶；显色液A液I瓶，7ml/瓶；显色液B液I瓶，7ml/瓶；终止液I瓶，.7ml/瓶；浓缩洗涤液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；浓缩样品稀释液(2X ) I瓶，40 ml/瓶。
专利摘要本实用新型涉及一种黄曲霉毒素B1的免疫学检测试剂盒。本实用新型的技术方案要点为一种黄曲霉毒素B1的免疫学检测试剂盒，包括盒体，其特征在于盒体内包含有酶标板、盖板膜、14瓶试剂和具有下凹瓶位的模具，所述的酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，微孔条上预包被黄曲霉毒素B1偶联抗原后固定于酶标板的外框支撑架上，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；所述的模具上具有14个下凹瓶位，14瓶试剂依次放入对应下凹瓶位内。本实用新型能实现快速、简便、灵敏、准确地对食品中黄曲霉毒素B1残留的定量、定性检测。
文档编号G01N33/558GK202614766SQ20122025248
公开日2012年12月19日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者姜金庆, 张海棠, 杨雪峰, 范国英, 梁新红, 张 浩, 莫海珍, 杨志, 李桂平, 李晨照 申请人:河南知微生物工程有限公司