复合酶制剂高效降解黄曲霉毒素B1的制备方法与流程

本发明属于酶制剂领域，涉及一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合酶制剂的制备方法。

背景技术：

黄曲霉毒素是一个典型的真菌次生代谢产物，其具有极强致癌、致畸、致突变性作用。黄曲霉的主要作用器官是肝脏，并能诱发肝细胞癌变，给人类和动物带来巨大的危害。黄曲霉毒素污染的范围比较广泛如花生、玉米、干果、牛奶等日常食物，因其毒性巨大，而越来越受关注。黄曲霉毒素对粮食的污染严重影响到各国的进出口贸易，给经济带来了巨大的损失。

黄曲霉毒素在结构上是由一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮环组成，其结构式中的不饱和内酯环结构以及双呋喃环是黄曲霉毒素强致癌性的原因。黄曲霉毒素B1是毒性最强的一种，当内酯环结构被破坏时，荧光性会消失，毒性也会随之减弱，因此将毒素降解的关键是将其结构破坏。传统方法去除黄曲霉毒素主要有物理吸附、臭氧处理、酸碱调控处理、辐射处理，但是传统物理化学方法处理黄曲霉毒素包含降解效率低，副产物多，操作复杂，成本高昂的缺点，因此迫切需求一种安全高效降解黄曲霉毒素的方法。

生物法降解黄曲霉毒素成为当今的热点，利用具备降解能力的真菌或者细菌降解黄曲霉毒素。经研究微生物降解黄曲霉毒素主要分为微生物吸附和微生物降解两种。微生物对黄曲霉毒素的降解主

要是其所产酶起作用效果。研究不同菌体胞外酶按照一定的组分百分比混合制成复合酶制剂高效降解黄曲霉毒素B1的研究甚少。

技术实现要素：

本发明在于提供一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合酶制剂的制备方法。

本发明的好食脉胞菌、雷斯青霉来自于实验室保藏，真菌漆酶源自于试剂公司购买。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合微酶制剂：由好食脉胞菌和雷斯青霉的粗酶制剂与真菌漆酶按照一定的组分百分比混合而成。

进一步在制备复合酶制剂时，由好食脉胞菌和雷斯青霉的粗酶制剂以及真菌漆酶分别以一定的组分百分比混合而成，并确保各自所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且两组分之和为100%。

本发明高效降解黄曲霉毒素B1的复合酶制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）发酵培养好食脉胞菌以及雷斯青霉，并将各自培养液置于离心管内离心5500rpm离心10分钟，将上清液与下层菌体分开，将上清液超滤浓缩10倍，采用50%的饱和硫酸铵沉淀，10000转离心5分钟，弃去上清，将沉淀蛋白进行磷酸盐缓冲液复溶，透析过夜之后进行冷冻干燥，进而将得到蛋白作为好食脉胞菌和雷斯青霉的粗酶制剂。

（2）将上述好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉的粗酶制剂和真菌漆酶

混合制成复合酶制剂，其中三者都满足所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且三组分之和为100%。

利用国标法（编号：GB/T 17480-2008）检测黄曲霉毒素B1的含量。黄曲霉毒素B1降解率利用以下公式计算:降解率=(1-样品中AFB1峰面积/空白对照中AFB1的峰面积)×100%。

黄曲霉毒素B1的制取：取粉碎的玉米、花生、小麦于锥形瓶中，加入蒸馏水搅拌均匀，灭菌之后接种黄曲霉菌悬液，置于恒温培养箱培养一周左右，取被黄曲霉污染的样品与烧杯中，加入甲醇充分搅拌使黄曲霉素充分溶解，纱布过滤残渣，向滤液中加入氯仿充分振荡萃取，取下层氯仿于旋转蒸发仪蒸干，色谱甲醇溶解，并于0.22微米滤膜过滤，利于HPLC进样并收集黄曲霉毒素B1出峰区间的流出样，进而得到纯化的黄曲霉毒素B1，检测其纯度可达95%。

本发明在研究复合酶制剂降解黄曲霉毒素B1的过程中，充分考虑到环境因素对其降解效果的影响。经过研究发现，通过控制降解温度以及降解pH，在相同的温度以及pH下，复合酶制剂对黄曲霉毒素B1的降解能力相比好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别单独降解同等浓度的黄曲霉毒素B1的降解率有显著的提升。

本发明考虑到将降解黄曲霉毒素B1作用位点存在差异的酶混合，充分发挥不同种类酶在体系中的互补作用以及与酶在降解毒素的过程中相互促进作用。研究环境因素影响对复合酶制剂降解黄曲霉毒素B1效率的过程中，控制降解黄曲霉毒素B1的温度为33℃～37℃，pH为5～7.5，以及酶液浓度和作用时间等重要条件。复合酶制剂在同等条件下降解黄曲霉毒素B1的效率相比好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂与真菌漆酶分别单独降解黄曲霉毒素B1的效率提高25%以上。

本发明一种高效降解黄曲酶毒素B1的复合酶制剂，控制复合酶制剂与黄曲霉毒素B1在降解体系中之比区间为0.2g/L·ppm～0.4g/L·ppm时，复合酶制剂在同等条件下降解黄曲霉毒素B1相比好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂与真菌漆酶分别单独降解黄曲霉毒素B1时表现出显著的用料节省性。

本发明主要是考虑到将能够降解黄曲霉毒素B1的微生物酶制剂混合，发挥酶复配之后产生的协同效应。将不同种粗酶制剂与真菌漆酶进行配比混合，使作用位点有差异以及作用位点相似的酶汇聚在相同的环境里，从而发挥酶与酶之间的互补和协同作用提升降解能力。

本发明的好食脉胞菌粗酶制剂内包含锰过氧化物酶能够作用于黄曲霉毒素B1的双呋喃环末端的双键，通过对双呋喃环末端的双键进行氧化和加成反应，生成AFB1-8,9-二氢二醇，从而降低黄曲霉毒素B1的毒性。雷斯青霉粗酶制剂将黄曲霉毒素B1的双呋喃环不饱和双键加氢消除，从而使黄曲霉毒素B1降解为黄曲霉毒素B2。真菌漆酶多为白腐真菌等发酵生产提取而成的，研究发现其作用黄曲霉毒素B1之后能够降低毒素的荧光强度，因此推测真菌漆酶解毒机理是使AFB1内酯环开环。复合酶制剂中三种组分对黄曲霉毒素B1的作用效果不同。

本发明复合酶制剂中，好食脉胞菌粗酶制剂和雷斯青霉粗酶制剂分别能够将黄曲霉毒素B1的双呋喃环不饱和双键进行氧化加成以及还原双键，从而降解并改变黄曲霉毒素B1的结构使其毒性降低。而源自于白腐真菌的真菌漆酶通过催化黄曲霉毒素B1的内酯环开环从而使毒素降解。将真菌漆酶与上述两种粗酶混合，汇聚了不同能力降解酶的共同点和特异性，同时发挥不同种类酶的作用位点互补作用，使复合酶制剂能够多方位降解黄曲酶毒素B1，三种酶在不同层次上降解黄曲霉毒素B1的同时相互促进，进一步将黄曲霉毒素B1彻底降解，从而整体提升对黄曲霉毒素B1的降解能力。

复合酶制剂在处理饲料中黄曲霉毒素B1中的应用。

本复合酶制剂具有降解黄曲霉毒素B1效率高、无污染、在降解饲料中的黄曲霉毒素具有广阔的前景。研究证明，将好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂以及真菌漆酶混合时，保证三者各自所占组分百分比在区间20%～60%以内，且三组分百分比之和为100%，在研究环境影响复合酶制剂降解黄曲霉毒素的过程中，控制降解黄曲霉毒素B1的温度为33℃～37℃，pH为5～7.5，所制成的复合酶制剂能够高效降解黄曲霉毒素B1，降解率区间为76%～89%。在最适温度33℃～37℃，pH为5～7.5研究复合酶制剂，复合酶制剂在同等条件下降解黄曲霉毒素B1的效率相比好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂与真菌漆酶分别单独降解黄曲霉毒素B1的效率提升25%以上。同时在控制复合酶制剂与黄曲霉毒素B1在降解体系中之比区间为0.2g/L·ppm～0.4g/L·ppm时，复合酶制剂在同等条件下降解黄曲霉毒素B1相比好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂与真菌漆酶分别单独降解黄曲霉毒素B1时表现出显著的用料节省性。

附图说明

图1为复合酶制剂在36℃，pH6.5，作用72小时后黄曲霉毒素B1剩余毒素浓度的示意图。图中1为初始检测的黄曲霉毒素B1含量，作为对照组。图中2、3、4分别代表好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别单独作用黄曲霉毒素B1剩余毒素浓度的示意图。5、6、7、8、9分别代表好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别以组分百分比（20%、20%、60%），（30%、30%、40%）、（40%、20%、40%）、（30%、40%、30%）、（50%、25%、25%）混合而成的复合酶制剂作用黄曲霉毒素B1剩余毒素浓度的示意图。控制每组酶制剂的加入量相同均为0.2g。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。

实施例1

发酵培养好食脉胞菌以及雷斯青霉，并将各自培养液置于离心管内离心5500rpm离心10分钟，将上清液与下层菌体分开，将上清液超滤浓缩10倍，采用50%的饱和硫酸铵沉淀，10000转离心5分钟弃去上清，将沉淀蛋白进行磷酸盐缓冲液复溶，透析过夜之后进行冷冻干燥，进而将得到蛋白作为好食脉胞菌粗酶制剂和雷斯青霉粗酶制剂，保存备用。

将好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别以组分百分比（20%、20%、60%）混合，称量0.2g复合酶制剂（其中包含0.04g好食脉胞菌粗酶制、0.04g雷斯青霉粗酶制剂、0.12g真菌漆酶），充分震荡溶解于1L无菌蒸馏水中制成酶液，使其在体系中的浓度为0.2g/L，加入黄曲霉毒素B1标准品使酶液中初始黄曲霉毒素B1浓度为1ppm。检测初始黄曲霉毒素B1的含量作为对照。此时复合酶制剂与黄曲霉毒素B1在降解体系中之比为0.2g/L·ppm。控制培养温度为36℃，pH为6.5培养72小时，检测剩余黄曲霉毒素B1的含量。

经检测，对照组黄曲霉毒素B1含量为956ppb，黄曲霉毒素B1剩余含量为110ppb，降解率最高可达88.5%。

实施例2

在实施例1制备好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂的基础上，将好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别以组分百分比（40%、40%、20%）混合制成复合酶制剂，称取0.4g复合酶制剂（包含0.16g好食脉胞菌粗酶制剂，0.16g雷斯青霉粗酶制剂，0.08g真菌漆酶），充分震荡溶解于1L无菌蒸馏水中制成酶液，使其在体系中的浓度为0.4g/L，加入黄曲霉毒素B1标准品使酶液中初始黄曲霉毒素B1浓度为1ppm。此时复合酶制剂与黄曲霉毒素B1在降解体系中之比为0.4g/L·ppm。控制培养温度为36℃，pH为6.5，检测黄曲霉毒素剩余含量为500ppb时所需要的降解时间.与复合酶制剂作为对比，同等条件下分别检测0.4g好食脉胞菌粗酶制剂、0.4g雷斯青霉粗酶制剂、0.4g真菌漆酶分别单独降解黄曲霉毒素B1使其浓度达到500ppb所需的时间。

经过检测，复合酶制剂降解黄曲霉毒素B1剩余含量为500ppb时所需要的时间仅为9小时，好食脉胞菌粗酶制剂降解黄曲霉毒素B1剩余含量为500ppb时所需要的时间为12h、雷斯青霉粗酶制剂降解黄曲霉毒素B1剩余含量为500ppb时所需要的时间为14h、真菌漆酶降解黄曲霉毒素B1剩余含量为500ppb时所需要的时间为13h，相对于三组分单独作用所需的时间，复合酶制剂效率提升了（25%、35.71%、30.77%）。

实施例3

在实施例1制备好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂的基础上，将好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别以组分百分比（40%、40%、20%），称取0.4g复合酶制剂（其中包含0.16g好食脉胞菌粗酶制剂、0.16g雷斯青霉粗酶制剂、0.08g真菌漆酶），充分震荡溶解于1L无菌蒸馏水中制成酶液，使其在体系中的浓度为0.4g/L，加入黄曲霉毒素B1标准品使酶液中初始黄曲霉毒素B1浓度为1ppm。检测初始黄曲霉毒素B1的含量作为对照。此时复合酶制剂与黄曲霉毒素B1在降解体系中之比为0.4g/L·ppm。控制培养温度为36℃，pH为6.5培养72小时。相同处理条件下，将好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶分别单独作用初始黄曲霉毒素B1浓度为1ppm的溶液，并检测达到与复合酶制剂降解率相同时假单胞菌粗酶制剂、分支杆菌粗酶制剂、真菌漆酶的分别用量。

经检测，对照组黄曲霉毒素B1含量为956ppb，在36℃，PH为6.5培养72小时剩余黄曲霉毒素B1含量为150ppb，降解率达到84.31%，相同条件分别使用好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶单独作用1ppm的黄曲霉毒素B1，检测剩余黄曲霉毒素B1含量为150ppb左右时所需制剂的用量，结果表明，好食脉胞菌粗酶制剂、雷斯青霉粗酶制剂、真菌漆酶的用量分别为0.88g,0.93g,0.96g，而复合酶制剂的用量为0.4g，表现出复合酶制剂的省料性。