一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株及其在花生黄曲霉毒素污染生物防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境生物技术领域，具体设及一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株及其 在花生黄曲霉毒素污染生物防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素是危害我国食品安全的一种很重要的真菌毒素。在自然界中，一些农 作物，包括玉米和花生容易受黄曲霉菌侵染，导致巧粒遭受黄曲霉毒素的污染；其他植物， 如坚果类也容易受到黄曲霉毒素的污染。黄曲霉毒素的毒性很强，是目前已知的毒性最强 的致癌性真菌毒素，其对人和动物的肝脏和中枢神经系统具有极强的毒害，长期小剂量摄 入可导致胚胎崎形变异、基因和染色体变异、诱发原发性肝癌、胃癌等癌症，而一次性大量 摄入可引起急性中毒甚至死亡。
[0003] 花生地上开花地下结果，运一生物学特性使芙果在花生生长期间易受到±壤中黄 曲霉菌的侵染而发生收获前黄曲霉毒素污染，尤其是破损的芙果更易被黄曲霉菌感染。防 控花生黄曲霉毒素污染的技术措施包括利用抗黄曲霉或抗旱的花生品种、改进栽培措施、 控制收获及胆藏过程的环境条件，但迄今国内外可用的高产优质的抗黄曲霉花生品种极 少，栽培防控的效果常因环境因素影响而降低，采用物理和化学方法对受污染的产品进行 脱毒，不仅成本高而且效果也不理想。利用生物防治技术是消除或减少毒素污染、保障花生 食用安全性的重要技术途径之一。
[0004]目前，黄曲霉毒素污染的生物防治技术最成功的手段是利用不产毒的黄曲霉菌 株。20世纪90年代W来，不产毒黄曲霉菌在花生、玉米和棉花等作物黄曲霉毒素污染防控 中得到一定的应用，在玉米田和花生田施用可使玉米、花生黄曲霉毒素减少74. 3% -99%。 田间施用不产毒菌株不仅可降低收获前毒素污染，还可降低收获后储藏期间的毒素污染。 世界上利用不产毒黄曲霉生防最成功的国家是美国，在澳大利亚也得到了一定的应用。但 总体上看，花生黄曲霉毒素污染的生物防治由于多种因素的限制，生产应用仍然十分有限， 而在我国几乎还是一项空白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株在花生黄曲霉 毒素污染生物防治中的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
[000引一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，该菌株命名为黄曲霉菌NAFFHN396,已于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 屯、，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为CGMCCNo: 10927。
[0009]上述黄曲霉菌NAFFHN396的菌落形态为：30°C黑暗培养7d后，在CYA培养基上，黄 曲霉菌NAFFHN396为直径6. 5cm的菌落，菌丝淡褐色，分生抱子黄褐色，菌落表面粉状；在AFPA固体培养基上，菌落背面为亮橘色。
[0010] 利用黄曲霉特异巧条蛋白基因设计的引物（CaMF和CaMR)扩增黄曲霉菌 NAF即N396的DNA，并进行序列分析，分析结果显示，特异巧条蛋白基因序列长度为75化P， 采用BLAST分析法将序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与黄曲霉菌的亲缘 关系最接近，同源性高达99 %W上。利用甲醇法提取接种了黄曲霉菌NAFFHN396培养7天 的CYA固体培养基，利用高效液相色谱OPLC)对提取液进行测定，测试结果显示：黄曲霉菌 NAFFHN396不产黄曲霉毒素。
[0011] 利用黄曲霉毒素合成簇及其上、下游共30个基因核巧酸序列设计的引物，对黄曲 霉菌NAFFHN396的DNA进行PCR扩增，PCR扩增结果见图3,图3的结果显示：该菌的黄曲霉 毒素合成簇缺失12个基因（第5~16个基因），黄曲霉菌NAFFHN396不产毒的机理是因为 在DNA水平上，黄曲霉毒素合成簇缺失12个基因，导致黄曲霉毒素合成中断。
[0012] 上述黄曲霉菌NAFFHN396在花生黄曲霉毒素污染生物防治中的应用。
[0013] 本发明将不产毒的黄曲霉菌NAFFHN396与强产毒的黄曲霉菌AF2202W1 :1比 例混合接种后分别在CYA固体培养基和花生仁上培养7天，结果显示：不产毒的黄曲霉菌 NAFFHN396在CYA上对产毒菌毒素产量的抑制率为94. 1 %，在花生仁上对产毒菌毒素产量 的抑制率达98%，显著降低强产毒的黄曲霉菌AF2202的黄曲霉毒素的产量。
[0014] 本发明的有益效果如下：本发明获得一株黄曲霉毒素合成簇基因缺失的不产毒黄 曲霉菌株，该菌株对强产毒黄曲霉菌的毒素产量具有显著的抑制作用，为今后不产毒黄曲 霉菌在田间的生物防治提供了生防菌来源，该菌分离自我国，在花生上具有较好的定殖能 力，具有潜在的田间竞争优势，对抑制产毒黄曲霉菌侵染花生，降低花生中的黄曲霉毒素污 染具有重要意义。
【附图说明】
[0015] 图1为黄曲霉菌NAFFHN396在CYA培养基上的菌落形态和分生抱子形态。
[0016] 图2为黄曲霉菌NAFFHN396在AFPA培养基上的菌落背面的颜色。
[0017] 图3为黄曲霉菌NAFFHN396和其他不产毒株系巧条蛋白的PCR扩增结果。
[0018] 图4为黄曲霉菌NAFFHN396的系统发育树。
[0019] 图5为黄曲霉菌NAFFHN396生长7d后的固体CYA培养基上毒素提取液的HPLC测 定图谱。
[0020] 图6为黄曲霉菌NAFFHN396中黄曲霉毒素合成簇上游基因及部分合成簇基因的扩 增结果。
【具体实施方式】
[0021] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0022] 实施例1 :菌株的分离、筛选和鉴定
[0023](1)将花生巧仁利用70%乙醇表面消毒30s，随后利用Iwt%化ClO浸泡巧仁 2min，无菌水洗涂3次，控干花生仁，将花生仁均匀排布于无菌的塑料培养皿中，10粒/皿， 巧仁间保持空隙，不紧挨；将装有巧仁的培养皿利用parafilm膜包好后，小屯、放置于底层 添加水分的整理箱中，盖好箱盖，30°C培养7d;
[0024] (2)利用灭菌的綴子薩取少量巧仁上产生的黄绿色分生抱子，在含有0.Iwt%的 Tween-20中充分悬浮并系列稀释后，取10 4稀释度的分生抱子悬浮液涂布PDA平板，30°C培养2d，将生长的单菌落取少许转接到新鲜的CYA和AFPA固体培养基中屯、，培养基为自然 pH，3(TC培养直至菌落长满平板，得到纯化的菌落，菌落的形态为：在CYA固体培养基上培 养7d后，NAF即N396为直径6. 5cm的菌落，菌丝淡褐色，分生抱子黄褐色，菌落表面中屯、毛 茸状，边缘粉状，菌落和分生抱子的形态见图1;在AFPA固体培养基上，菌落背面为亮橘色